【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 化黃酮及二氫黃酮 、 異黃酮 ， 則無須減活性 。 2. 利用分子大小不同，用葡聚糖凝 膠分子篩分離 主 要 用 兩 種 型 號(hào) 的 凝 膠 SephadexG 型和SephadexLH20型 分離游離黃酮主要是吸附作用 ， 極性小 ?大洗脫 。 分離黃酮苷類 ， 主要是分子篩作用 ， 分子大 ?小洗脫 。 總的洗脫順序：糖多的苷 ?糖少的苷 ?游離苷元（ 極性小 ?大 ） 常用洗脫劑： ① 堿性水溶液 ， 含鹽水溶液 ② 醇及含水醇 ③ 含水丙酮 ， 甲醇－氯仿 ３．利用酸性強(qiáng)弱，采用 pH梯度萃取法 ? 混合物溶 于有機(jī) 溶劑 ， 依次用 ５ ％NaHCO ５ ％ Na2CO %NaOH、4%NaOH萃取 ， 相應(yīng)的黃酮類化合物洗脫順序： 7,4’－二羥基 ?7或 4’羥基 ?一般酚羥基 ?５－羥基黃酮 ? ４．根據(jù)分子中某些特定官能團(tuán)進(jìn)行分離 ? 醋酸鉛沉淀法 ? 硼酸絡(luò)合法：根據(jù)具有鄰二酚羥基的黃酮與硼酸絡(luò)合 ， 生成物易溶于水的性質(zhì)與其它類型黃酮分離 。 通常在不與水混溶的有機(jī)溶劑如乙醚中 ，用硼酸液萃取 ， 水相即為鄰二酚羥基類黃酮 。 ? 舉例：從芹菜［ Apium graveolens L.］種子中分離 graveobiodide A及 B R = 芹 菜 糖I I （ 無 鄰 二 酚 羥 基 ）I （ 具 有 鄰 二 酚 羥 基 ）OOR OO HO C H 3O HOOR OO HO HO H淺 黃 色 蔟 狀 結(jié) 晶 ( g r a v e o b i o s i d e A ) ( I )乙 醇 重 結(jié) 晶黃 色 結(jié) 晶濃 縮 至 小 體 積 ，冰 箱 放 置沉 淀 ( P b S )濾 液淺 黃 色 針 晶 ( g r a v e o b i o s i d e B ) ( I I )乙 醇 重 結(jié) 晶黃 色 結(jié) 晶溶 于 少 量 乙 醇 中 ， 放 置晶 塊同 鉛 鹽 ( A ) 法 進(jìn) 行 復(fù) 分 解黃 色 鉛 鹽 沉 淀 ( B )加 入 堿 式 醋 酸 鉛 的 熱 水 溶 液 至 沉 淀 完 全 ， 過 濾懸 浮 乙 醇 中 ， 通 H2S ， 過 濾濾 液棕 色 沉 淀 ( A )溶 于 熱 水 中 ， 煮 沸 ， 逐 滴 加 入 中 性 醋 酸 鉛 的 熱 水 溶 液 ，直 至 不 再 析 出 沉 淀 為 止 ， 乘 熱 過 濾醚 不 溶 物減 壓 濃 縮 后 ， 用 醚 處 理 雜 質(zhì)提 取 液乙 醇 提 取脫 脂 藥 料石 油 醚 浸 泡 脫 脂原 料 （ 種 子 ）第四節(jié) 黃酮類化合物的檢識(shí)與結(jié)構(gòu)測(cè)定 目前主要采用的方法有： ① 與標(biāo)準(zhǔn)品或與文獻(xiàn)對(duì)照 PPC或 TLC得到的 Rf或 hRf值 （ Rf?100） ② 分析對(duì)比樣品在甲醇溶液中及加入酸 、堿或金屬鹽類試劑后得到的 UV光譜 ③ 1HNMR ④ 13CNMR ⑤ MS 一、層析在黃酮類鑒定中的作用 1. 紙層析 (PPC) 苷類成分可采用雙向展開 ， 第一相展開采用醇性溶劑 ， 如 BAW系統(tǒng) （ 正丁醇： 醋酸：水 4： 1： 5上層 ） ；第二相展開用水性溶劑 ， 如氯仿：醋酸：水 （ 3： 6： 1） 苷元?jiǎng)t多采用醇性溶劑 。 花色苷及其苷元 ， 可用含鹽酸或醋酸的溶劑 。 2. 薄層層析 (TLC) １ ） 硅膠薄層 用于弱極性黃酮較好 。 常用甲苯：甲酸甲酯：甲酸 （ 5： 4： 1） ；苯：甲醇 （ 95： 5） 或苯：甲醇：冰醋酸 （ 35： 5： 5）等 。 ２ ） 聚酰胺層析 適用范圍廣 ， 可分離含游離酚羥基或其苷類 。 常用展開系統(tǒng)：乙醇：水 （ 3： 2） ；丙酮：水（ 1： 1） 等 。 顯 色 劑 ： 紫 外 光 ； 2% 三氯化鋁甲醇液； 1%FeCl3 / 1%K3Fe(CN)6(1:1)混合液 。 二、紫外光譜在黃酮類鑒定中的應(yīng)用 可用于確定黃酮母核類型及確定某些位置是否含有羥基 。 一般程序： ① 測(cè)定樣品在甲醇中的 UV譜以了解母核類型； ② 在甲醇溶液中分別加入各種診斷試劑后測(cè) UV譜和可見光譜以了解 3,5,7,3’,4’有無羥基及鄰二酚羥基； ③ 苷類可水解后 （ 或先甲基化再水解 ） ， 再用上法測(cè)苷元的 UV譜以了解糖的連接位置 。 （一）黃酮類化合物在甲醇溶液中的紫外光譜 多數(shù)黃酮類化合物由兩個(gè)主要吸收帶組成： 帶 I在 300400nm區(qū)間 ， 由 B環(huán)桂皮酰系統(tǒng)的電子躍遷所引起； OOOO帶 II在 240285nm區(qū)間，由 A環(huán)苯甲酰系統(tǒng)的電子躍遷所引起。 OOOO 帶 II(240285nm) （ 苯甲酰系統(tǒng) ） 帶 I(300400nm) 桂皮酰系統(tǒng) 類 型 說 明 250285 304350 黃酮類 OH 越多 ，帶 I帶 II越紅移 B環(huán) 3’,4’有 OH基 ， 帶 II為雙峰 （ 主峰伴肩峰 ） 328357 黃酮醇類 (3OR) 352385 黃酮醇類(3OH) 245270 270295 300400 異黃酮類 二氫黃酮（ 醇 ） B環(huán)上有 OH, OCH3對(duì)帶 I影響不大 220270 340390 或 340390(Ia) 300320(Ib) 查耳酮類 查耳酮 2’OH使帶 I向紅移影響大 370430(34個(gè)小峰 ) 橙酮類 不同類型黃酮類化合物的紫外光譜 2．加入診斷試劑后引起的位移及結(jié)構(gòu)測(cè)定 加入試劑 帶 II 帶 I 說明 樣品+MeOH 250285 304385 兩峰強(qiáng)度基本相同 ， 具體位置與母核上電負(fù)性取代基 (OH, OCH3)有關(guān) ， OH, OCH3越多 ，越長(zhǎng)移 +NaOMe 或+NaOH A 環(huán)有 OH ， 紅移小 ， 無意義 ?4060nm（ ?不變或增強(qiáng) ） ?5060nm（ ?下降 ） 有 4’OH， 無 3OH 有 3OH， 無 4’ OH 有 3,4’OH或 3,3’,4’OH（ 衰減更快 ） 7OH 帶 I， II隨加 NaOMe時(shí)間延長(zhǎng) ， 逐漸衰減 320330nm有小峰 +NaOAc (未熔溶 ) ?520 有 3OH,4’OH 也發(fā)生紅移 ，但意義不大 7OH 加入試劑 帶 II 帶 I 說明 +NaOAc/ H3BO3 ?510 ?1230 有 6,7OH 或 7,8OH (5,6OH無 ) B環(huán)有鄰二酚羥基 AlCl3/ HCl ?60 ?5060 ?3555 ?1720 ?0 有 3OH 有 3,5二 OH 有 5OH， 無 3OH 有 6OR 無 3OH, 5OH或 6OR存在 AlCl3光譜 AlCl3/ HCl光譜 3040 5065 0 B環(huán)有鄰二酚羥基 A,B環(huán)皆有鄰二酚羥基 A,B環(huán)皆無鄰二酚羥基 說明： 1） +NaOMe, OH?OMe， 紅移 另有有 3,4’OH 或 3,3’,4’OH 時(shí) ， 在 NaOMe作用下易氧化破壞 ， 故峰有衰減 。 2） NaOAc為弱堿 ， 僅使酸性較強(qiáng)者 ， 如7,4’OH解離 。 OOO 3） H C l / H 2 OA l C l 3A l3 +OOO HO HOH OA l3 +A l3 +OOOOOH OOOO HO HH OO H形成絡(luò)合物的能力： 黃酮醇 3OH 黃酮 5OH（ 二氫黃酮 5OH） 鄰二酚羥基 二氫黃酮醇 5OH 鄰二酚羥基和二氫黃酮醇 5OH在酸性條件下不與AlCl3絡(luò)合； 但不在酸性條件下 ， 五者皆與 Al3+絡(luò)合； 形成絡(luò)合物越穩(wěn)定 ， 紅移越多 。 4） 二者相減可檢測(cè)鄰二酚羥基 。 “中藥化學(xué) ” p296例 從中藥柴胡中得到山奈苷，酸水解 PPC檢查出鼠李糖，該苷及苷元的UV[λmax(nm)]譜如下，解析結(jié)構(gòu)。 ? 山奈苷 帶 II 帶 I ? MeOH 265 345 ? NaOMe 265 388 Δ43， 4’OH ? AlCl3 275 399 Δ54， 5OH ? AlCl3/HCl 275 399 ? AlCl3= AlCl3/HCl：無鄰二酚羥基 ? NaOAc 265 399 ? 帶 II無紅移，無 7OH ? NaOAc/H3BO3 265 386 Δ41? ? 山奈苷元 帶 II 帶 I ? MeOH 265 367 ? NaOMe 276 424（分解） 帶 I紅移 Δ57，且分解， 3， 4’OH ? AlCl3 270 424 Δ54， 5OH ? AlCl3/HCl 269 424 ? AlCl3= AlCl3/HCl：無鄰二酚羥基 ? NaOAc 276 387 ? 帶 II紅移 20， 7OH ? NaOAc/H3BO3 267 387 Δ40? 山奈苷元與山奈苷相比：山奈苷的帶I(345nm)比山奈苷元的帶 I(367nm)紫移22nm，說明 3OH苷化。 山奈苷元與山奈苷的分析結(jié)果表明：苷元比苷多了 3和 7’羥基，表明山奈苷是 3， 7’位鼠李糖苷。 三、 1HNMR ? 常用溶劑：氘代氯仿 （ CDDl3） ， 氘代二甲基亞砜 （ DMSOd6） ， 氘代吡啶（ C5D5N） 。 ? 也可將黃酮類化合物作成三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中進(jìn)行測(cè)定 。 ? ? 優(yōu)點(diǎn)： ① 無干擾信號(hào) ， 勿須昂貴的氘代試劑； ② 供試后的樣品用含水甲醇處理可回收； ③ 三甲基硅醚衍生物可很方便的轉(zhuǎn)變成乙酰衍生物或甲醚衍生物 。 ? h e s p e r i d i nM e O H H 2 Oh e x a t r i m e t h y l s i l y l r h a g l c OOOO S i ( C H 3 ) 3O C H 3O S i ( C H 3 ) 3p y r i d i n( C H 3 ) 3 S i C l[ ( C H 3 ) 3 S i ] 2 N Hr h a g l c O OOO HO C H 3O H（一） A環(huán)質(zhì)子 1． 5, 7二 OH黃酮