【文章內容簡介】 洗時不徹底，導致鈦材表面殘留有雜質，在掃描電鏡下表面粗糙不平整。觀察圖(b)、(c)和(d)（分別是以20和40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材）發(fā)現鈦材表面逐漸趨于平整此結果說明醋酸鋅溶液在鈦材表面成功的進行了層層組裝。由于(b)、(c)和(d)的平整度變化說明了隨著醋酸鋅溶液濃度的增加層層自組裝的效果更佳。 觀察40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材的能譜圖，如圖2，從圖中可知涂層中主要含有鈦、鋅、氮、金這幾種元素。鋅元素的出現說明了實驗成功的將鋅離子通過層層組裝處理構建于鈦材表面。而金元素的出現是因為在對鈦材進行檢測時，對其表面進行了噴金的操作。圖2以40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材的能譜圖表3展示了以40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材的表面化學組成與元素的具體含量。其中鈦元素（Ti）%，金（Au）%，鋅（Zn）%，氮(N)%。表3 以40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材的表面化學組成基材Ti(wt %)Au(wt %)Zn(wt %)N(wt %)TiLBL(Zn)本實驗利用層層自組裝技術成功地將鋅離子構建到鈦材表面，使得心離子粘附在鈦基植入材料表面形成一層含鋅離子的薄膜，改變了鈦基植入材料的表面特性；并嘗試將其應用于外植體表面抗菌涂層的研究，因為鋅離子具有殺菌能力當其通過層層自組裝技術黏附在鈦基植入材料表面，所以鈦材料獲得了抗菌能力。利用掃描電鏡、EDS能譜等對鈦材表面涂層的結構和表面形貌進行表征并測定了改性后鈦材表面化學組成及其元素含量，證實了在材料表面形成了含鋅離子薄膜。實驗研究表明，層層自組裝技術在鈦材表面建立含鋅離子的抗菌涂層時，鋅離子的濃度是可控的，我們可以根據實際需求來實現對鈦材表面的改性。 10 3 改性后鈦材的抗菌能力評估 鈦合金由于其優(yōu)良的力學性能與耐腐蝕性，同時兼具有良好的生物相容性，使鈦合金成為了當下臨床骨組織修復和替代使用的重要材料。然而，術后感染成為臨床應用中醫(yī)療設備植入失敗的常見原因之一。外植物表面的細菌粘附是引起外植物感染的主要原因。材料表面引起的感染往往會導致外植物過早松動和脫落，并可能誘發(fā)鄰近組織和器官的感染嚴重時甚至會使組織和器官壞死，給患者帶設備反復植入的痛苦和嚴重的經濟負擔。鈦材料也面臨同樣的難題，近年來，隨著鈦合金材的植入物表面改性方法的廣泛研究，在鈦合金表面引入相關的有機或無機物質實現對鈦合金材表面進行針對性的改性，從而改善鈦合金植入物的缺陷，使鈦合金材料更加符合人們需要的需要[22]。研究發(fā)現,剛進行植入手術后最容易引發(fā)感染。金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞桿菌在醫(yī)院內分布最為廣泛，也是引發(fā)術后感染的主要病原菌。銅綠假單胞桿菌和金黃色葡萄球菌都具備較強的化學藥物抵抗能力。近年來由于濫用抗生素，這兩種菌的耐藥性越來越高[23]。隨著感染菌的耐藥菌株的不斷產生，藥物的效果逐漸減弱，導致了患者術后費用越來越高，但患者的病痛卻并沒有得到有效的治療。本實驗通過納米鋅抗菌涂層的鈦材在金黃色葡萄球菌上進行的一系列抗菌測試，來驗證通過涂覆納米鋅的鈦材是否具有了目標改性功能，對表面改性后的鈦材的抗菌性進行評估，檢測材料是否具有優(yōu)良的抗菌性能[34]。材料：金黃色葡萄球菌菌株（重慶大學生物工程學院），肉湯培養(yǎng)基（青島日水生物技術有限公司，MH肉湯，配制比例21g/L H2O），cck8試劑（購于碧云天生物技術研究所，產品編號C0038）實驗儀器：1) CO2培養(yǎng)箱 （SHELLAB）2) 培養(yǎng)瓶 （Greiner）3) TL16R臺式高速冷凍離心機 （上海偉業(yè)儀器廠）4) 超凈工作臺 （上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療儀器設備廠）5) 數碼相機 （C5050 型，OLYMPUS）6) 倒置相差顯微鏡 （IX71 型，OLYMPUS）7）酶標儀：Model 550，美國BIORAD 公司在本次研究中，我們使用金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽性菌，是人類的一種重要病原菌，在與其斗爭的歷史中，因為抗生素的濫用，使的這種菌的耐藥性越來越強，一般的小劑量抗生素對其起到的效果非常微小，而術后的患者本身的抵抗力降低，無法大量的使用高劑量的藥品，不然會給患者帶來巨大的痛苦甚至生命危險[25]。因此如何使植入物本身帶有一定的抗菌能力，并降低術后的感染，成為了當今研究的熱點。因本次實驗中，我們所使用的金黃色葡萄球菌菌株是放入冰箱中進行了凍存的菌株，在進行下面一系列的抗菌性能測試實驗前，我們先要先對菌株進行活化操作，然后培養(yǎng)成復壯后的菌株，才能進行研究。而菌株活化操作的是否成功也將影響到我們后面的結果的準確性，因此這一步操作是非常重要的。菌種的保藏和復蘇是我們進行菌株實驗中經常接觸到的東西，因為菌種是我們生物類專業(yè)這種從事微生物學以及生命科學研究中最為基本的科學研究材料，特別是相關的使用微生物進行有關的研究實驗或生產離開菌株是不能進行下去的，因此菌種也是國家的一種重要資源[26]。菌種保藏的主要原理是根據所需要保藏的微生物的生理生化特點，并對其保存的環(huán)境進行針對化的改造，創(chuàng)造一種使微生物代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的保存環(huán)境，對于環(huán)境的改造我們可以采用的方法有低溫、干燥、缺氧這3種[27]。通過這些手段的使用，我們可以使菌種暫時處于休眠狀態(tài)，降低它的生物活性。本次實驗中，我們的菌株是存放在低溫干燥的冰箱中進行保藏的，所以我們在對菌株復蘇時，首先我們將冷凍的菌種解凍，即將所需的菌種從保藏狀態(tài)的溫度恢復到室溫狀態(tài)，這一步我們可以將菌株放入3040℃的水浴鍋中12分鐘，或者將裝有菌株的保存管放在手中進行反復搓動，利用體溫同樣可以達到水浴鍋的效果[39]。在恢復室溫后，將菌株接種在合適的培養(yǎng)基上進行23代的培養(yǎng)即可將菌株恢復到保藏前的活性。而本次實驗中，我們所使用的菌株是保存在低溫干燥的冰箱中，溫度并不是特別低，所以在傳代復蘇時，我們只需要進行12次的傳代即可將菌株的活性恢復?；謴秃笾苽渚何覀兙涂梢赃M行下面一系列的實驗了。金黃色葡萄球菌菌液的制備：在接種菌株之前，首先要按一定的比例(MH肉湯，21g/L H2O)配制好實驗所需的肉湯培養(yǎng)基，配制完成后，為確保實驗這個過程的沒有其他的雜菌污染，所以要將培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋內滅菌30min，滅菌后可以放入4℃的冰箱中進行凍存?zhèn)溆?。接種前，將超清工作臺提前打開用紫外滅菌15min，將菌株從冷藏箱中取出后，我們把裝有菌株的凍存管放入手心進行搓動，在肉眼下看到冰凍的菌液化開形成液體即可停止，在超清工作臺內將金黃色葡萄球菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，接種完成后，放入37℃的搖床內，設置轉速為100rpm，培養(yǎng)24小時，即可得到抗菌測試所需的金黃色葡萄球菌懸液。接種后的凍存管用新的封口膜封口，重新放入冰箱內，以便下次使用[28]。1） 將經過待測鈦片放入24孔板中，106cells/cm2的肉湯培養(yǎng)液。2） 將24孔板放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，除去培養(yǎng)液并加入PBS緩沖液放置于水平轉搖床上清洗3次，每次5分鐘。3） 吸出PBS緩沖液并向每孔加入質量體積比為4％的多聚甲醛溶液在4℃下固定30分鐘。4） 去除多聚甲醛溶液，每次4分鐘。5） 隨后進行梯度脫水，依次加入20％、50％、80％、100％的乙醇/PBS混合液每次脫水10分鐘。6） ，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育10分鐘。7） 10分鐘后吸出叔丁醇將樣品放入冷凍干燥機中干燥12小時。8） 對樣品進行噴金處理，而后再電子顯微鏡下觀察。抑菌圈實驗法是對殺菌劑、防霉劑的作用效果進行測量的一種方式，主要用于測定所需的殺菌劑或防霉劑對細菌、霉菌、酵母菌的殺菌抑制作用，它是一種簡單有效的定性或半定量的方法。這種實驗方法主要是通過殺菌防霉劑在適當的瓊脂平板上的擴散能力來初步的對試劑的殺菌抑制作用進行簡單的測量，進而得知這種殺菌劑的殺菌能力，并對以后的實驗提供改進的數理依據。這種實驗方法的基本原理和步驟是，根據我們需要研究的對象菌種，提前將試驗菌鋪好平板，在已接種供試菌的瓊脂培養(yǎng)基上，均勻的鋪上實驗用的少量殺菌劑，使殺菌劑和培養(yǎng)基表面接觸，在培養(yǎng)基的表面殺菌劑和試菌相互接觸作用。在一定溫度下培養(yǎng)一定時間后，由于殺菌劑在培養(yǎng)基表面上的滲透擴散作用，涂抹了殺菌劑的部位會因為殺死了病菌而抑制了其在培養(yǎng)基上的生長，在其周圍出現一圈規(guī)律的空白圈，這就是抑菌圈。通過以前的研究，我們可以得知在一定范圍內，抑菌圈的直徑與藥劑濃度的對數呈直線函數關系，因此我們可以從抑菌圈的直徑上進行數據分析，就能得到對供試樣品殺菌活性大小的評估[2[29]。由于金黃色葡萄球菌在環(huán)境中的廣泛存在，而且它是人類的一種重要病原菌，人們對它的生長特性和形態(tài)已有過大量研究，因此利用其檢測上面經過改性的鈦材料樣本的抗菌性能。抑制圈實驗參照相關文獻進行(Zhiyong, Fanet al. 2006)。實驗過程：首先將上面制備好的改性鈦片經過紫外照射，把鈦片的兩面都進行滅菌，滅菌時間為120分鐘。