【文章內(nèi)容簡介】 核）。B：當細胞進入有絲分裂期，核消失，特殊的是無胞質(zhì)分裂，核分裂產(chǎn)生的一對子細胞核在第11細胞周期間期再次出現(xiàn)于胞質(zhì)中。在每一間期早期核均為球形（C），隨后，在再一次進入有絲分裂期之前，核變大呈橄欖球形（D）。YSL核在有絲分裂期再次消失（E：第11次有絲分裂，注意到間期細胞核只在胚層細胞中出現(xiàn)，而不是在YSL中，意味著胚層和YSL已不再同步），間期又再次出現(xiàn)（F：第12細胞周期間期），如此經(jīng)過數(shù)個有絲分裂周期，總是位于公共的合胞體內(nèi)。引自Kimmel and Law (1985b)，經(jīng)Academic Press惠允。比例尺=50μm在激進插入發(fā)生的同時卵黃細胞也發(fā)生明顯的形態(tài)變化，IYSL表面向動物極膨出或是“隆起”，這一變化是外包開始最明顯的標志（圖8E），同時也大大增加了IYSL與胚盤內(nèi)表面的接觸面積。卵黃細胞由于隆起而占據(jù)了深層細胞因激進插入而空出的區(qū)域，同時也對深層細胞的外移施加了驅(qū)動力。不論外包運動的結(jié)果如何，它都很明顯同時包括了胚盤和卵黃細胞的運動，并且迅速發(fā)生。在隨后的數(shù)小時內(nèi)，隨外包的繼續(xù)，EYSL也繼續(xù)前行，穿過卵黃直達依附其上的細胞前方。至少在克鯉魚，橋粒（desmosome）有助于將EYSL和EVL邊緣連接起來（Betchaku and Trinkaus, 1978），而不斷伸展的YSL似乎將EVL丟在了后邊。外包似乎有賴于功能微管（Strahle and Jesuthasan, 1993）并可能受控于早期作用的合子基因（Kane, 1991）。目前已知最早表達的基因編碼位于局部的推定轉(zhuǎn)錄因子（putative transcription factors）并在囊胚晚期表達（如notail基因，SchulteMerker et al., 1992；goosecoid基因，Stachel et al., 1993；snaill基因，Thisse et al., 1993）。在囊胚期EVL也發(fā)生變化。在卵裂期結(jié)束時EVL細胞數(shù)比深層細胞數(shù)多，但隨著連續(xù)分裂EVL細胞數(shù)目大增，EVL變平、變薄，明顯延伸最終形成密封的更難看到的上皮單層。囊胚晚期，EVL細胞周期比深層細胞周期更長，并表現(xiàn)出更少的同步性。同時EVL細胞也有了世系限制，其細胞分裂產(chǎn)生的子細胞總在EVL內(nèi)。但其發(fā)育潛能在囊胚晚期似并未受到限制，如將其逐個移至深層細胞，其子代將獲得新的分化方向。囊胚期的分期128細胞期（ h）.第8細胞周期始于128個細胞排列成高的細胞堆疊，位于卵黃細胞之上，呈緊密半球形。與早先卵裂不同，這一結(jié)束64細胞期的卵裂溝很不規(guī)則，以至于此后幾無例外無法從細胞位置推斷其祖系。然而我們?nèi)匀豢梢耘卸硞?cè)面觀是對應于先前的奇數(shù)次卵裂面（正面觀，見前文）還是偶數(shù)次卵裂面，因為胚體仍和4細胞期描述的那樣為橢球形。從正面觀，EVL細胞在動物極和外圍之間排列成約5個不規(guī)則的層。256細胞期（2. 5 h）.第8組卵裂結(jié)束時的正面觀（圖8A）顯示EVL細胞形成7個不規(guī)則的層。在第９細胞間期，EVL細胞高度變薄，深層細胞數(shù)目大大超過了EVL細胞數(shù)目。第9次卵裂也是最后一次高度同步或間時同步的分裂。512細胞期（2. 75 h）.此期開始囊胚中期轉(zhuǎn)變；細胞周期在后幾次分裂中不斷延長（圖9A）。正面觀，在動物極和外圍之間有9個不規(guī)則的層。在此期的后半部尤其在正準備進入第10次有絲分裂時，外圍細胞（第一層EVL細胞）失去其連接卵黃細胞的底部邊界（圖10A,B）。這一形態(tài)學變化預示著YSL形成的開始；外圍細胞在第10次有絲分裂后特異性地不進行胞質(zhì)分裂。第10次卵裂相當同步，以致我們在1分鐘左右的時間里仍能看到所有細胞（包括卵黃細胞）都處于有絲分裂期（即無間期細胞核，圖10C），512細胞期是可能發(fā)生此類情況的最后一個細胞周期。1 k細胞期（3 h）.我們?？煽吹結(jié)SL形狀不規(guī)則并將共約20細胞核包含在圍繞胚盤邊緣的單一環(huán)中（圖10D）。第10次卵裂后的細胞數(shù)少于1024，因為在前一分期第一層（最外層）EVL細胞被并入了YSL。此外，還因為YSL的形成方式，此期組成第一層YSL的細胞是前一分期第二層YSL細胞的子細胞。在某些胚胎，YSL經(jīng)由兩個細胞周期才形成，其開始時間可能早于也可能晚于1 k細胞期。YSL約有11層細胞。第11組有絲分裂的發(fā)生猶如波線穿過胚盤，這也是最后一次發(fā)生此種情況。在此期間，第一次可以看到許多細胞與其它細胞不同步，一些由間期細胞核，一些則沒有。高囊胚期（ h）.此期標志著胚盤“高聳”于卵黃細胞之上的終結(jié)（圖8B,C）。在外圍細胞和YSL相遇處仍有一緊縮的環(huán)，或稱縊痕?？梢酝ㄟ^胚盤細胞和YSL細胞核的外形和數(shù)目來區(qū)別高囊胚期與其前面的分期。側(cè)面觀可見在外圍和動物極之間有至少11層EVL細胞。在整個高囊胚期胚盤的任一區(qū)域總有一些細胞處于間期，而另一些細胞則處于有絲分裂期。大部分胚盤細胞已完成第12次合子細胞周期，而有一些在此期已完成第13個合子細胞周期。YSL仍是薄的環(huán)形，但其外周輪廓更為平滑。YSL細胞核在其第2次分裂（第11次卵裂）時再次出現(xiàn)，通常仍都處于胚盤邊緣之外，并相互包裹得更緊密（圖10F）。橢形期（ h）.隨著胚盤向卵黃的壓縮，動植物極軸變短?？梢韵胂?，這是由于表面持續(xù)增加的張力引起的。自從1細胞期非卵黃細胞質(zhì)升高開始形成的胚盤外圍縊痕在此期減弱（圖8C）直至消失。最終從側(cè)面觀胚盤變?yōu)檩喞交臋E球形，因而此期被稱為橢形期。此時，卵裂高度不同步，其中許多處于第12或13次細胞周期。EVL此時極薄，須用Nomarski光鏡仔細觀察才能看到。YSL在胚盤底部伸展開，同時也與胚盤分離。在此期間，YSL核形成數(shù)排，其中一些細胞核永久地留在了IYSL。球形期（4 h）.動植物極軸的持續(xù)縮短使得囊胚晚期變?yōu)槠交慕蝮w。其整體形狀在此后數(shù)小時內(nèi)略有變化，很好地進入了原腸期，而細胞重排比以往任何發(fā)育階段都要快?？赏ㄟ^對胚盤下部和卵黃細胞上部的IYSL深層平面聚焦，根據(jù)其形狀區(qū)分球形期與其后的穹頂期，在前者該平面是平的或近于平的（圖8D）。此期大部分胚盤細胞處在第13次細胞周期，在EVL,此期尤其長，以至于EVL中很少發(fā)生有絲分裂。EYSL通常比前期明顯變薄，大部分YSL細胞核是內(nèi)在的。YSL發(fā)生最后一次核分裂。通常，去絨膜胚胎動物極開始豎起，而不是像先前那樣倒在一邊。穹頂期（ h）.IYSL表面深入胚盤，開始向動物極隆起（圖8E）。這一發(fā)生于卵黃細胞和胚盤界面的顯著而快速的變化是外包運動開始的確切信號。EVL細胞處在較長的第13細胞周期，而許多深層細胞已進入第14細胞周期。EYSL開始變窄（SolnicaKrezel and Driever, 1994）。YSL細胞核處于有絲分裂后期，也就是說，與穹頂期前的有絲分裂期相比，此時的細胞核總是可見的，它們開始變大，很容易看到。30%外包期（ h）.外包運動，包括卵黃細胞的隆起，產(chǎn)生所謂的胚層（blastoderm），厚度幾乎一致（圖8F）。此時的胚層包括高度平坦的EVL單層（須用Nomarski光鏡嚴格聚焦于胚層表面，否則不易見）和約4層細胞厚的深層細胞多層（deep cell multilayer , DEL）。胚層包被卵黃的程度提供了極有用的分期指標。我們定義外包百分率（percentepiboly）指從此期開始直至外包結(jié)束胚層所包被卵黃的程度。覆蓋百分率（percentcoverage）可能會更準確地表達這一意思，但外包百分率著重于過程，且使用更為廣泛。因此，30%外包時，是指沿動植物極軸估計，胚層邊緣達動植物極距離的30%。此期許多胚胎的胚層厚度并不嚴格一致。由于囊胚繞動植物極旋轉(zhuǎn)，從側(cè)面觀察將會看到其邊緣某一區(qū)域明顯比其它地方薄而平。這一區(qū)域?qū)l(fā)育為胚胎背側(cè)（Schmitz and CamposOrtega, 1994）。用低倍Nomarski光鏡最容易觀察到這一不對稱性。然而要完全確定背側(cè)尚需等到胚盾期（6 h）。原腸期 ()外包運動的繼續(xù)，以及形態(tài)發(fā)生細胞的內(nèi)卷（involution）、集合（convergence）和延伸（extension）運動的發(fā)生，產(chǎn)生了原始胚層和胚軸。內(nèi)卷運動的開始意味著原腸期的開始，目前可以說是發(fā)生于50%外包時（圖11A）。結(jié)果在達到50%外包后的數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)了一個增厚的外圍區(qū)域，稱作胚環(huán)（germ ring），幾乎與此同時完全包圍了囊胚邊緣（圖11B，及C箭頭所指）。隨后集合運動幾乎同樣快速地沿胚環(huán)產(chǎn)生一個局部的堆積，稱胚盾（embryonic shield , 圖11D，及E箭頭所指）。在發(fā)生這些事件期間，外包暫時中止，但胚盾形成后外包又繼續(xù)。胚層邊緣沿卵黃細胞延伸直至將其完全包繞（圖11FL）。其延伸近乎恒定速度進行，約每小時包繞卵黃細胞的15%，這也提供了大部分原腸期分期的有用指標（圖12）。正因為囊胚期沒有囊胚腔，原腸期既沒有消化道（archenteron），也沒有胚孔（blastopore）。DEL細胞在胚層邊緣進行內(nèi)卷，因而發(fā)揮了胚孔的作用。內(nèi)卷通過將胚層向后折疊形成胚環(huán)。因此，胚環(huán)內(nèi)由兩個胚層：位于上方的稱上胚層（epiblast），在整個原腸期繼續(xù)給位于下方的下胚層（hypoblast）提供細胞。注意到上、下胚層這些術語可同樣描述鳥類胚層結(jié)構(gòu)，但所命名的胚層在這兩種脊椎動物中似乎完全不同。圖 11 . 原腸期發(fā)育。除特別標注外均為左側(cè)觀，前側(cè)朝上，背側(cè)朝左。A：50%外包期（）；B：胚環(huán)期（）；C：動物極觀胚環(huán)期，箭頭指示胚環(huán)，胚盾將發(fā)育于胚環(huán)右下方的平坦區(qū)域；D：胚盾期（6h），胚盾標志背側(cè)，是胚環(huán)左側(cè)增厚區(qū)域；E：動物極觀胚盾期，箭頭指示胚盾；F：70%外包期（），左邊的胚層背側(cè)比右側(cè)的胚層腹側(cè)厚，前軸下胚層或脊索前板（prechordal plate，箭頭所示）延伸近動物極；G：70%外包期腹側(cè)觀，但微向前側(cè)傾斜以顯示此時很明晰的軸下胚層（箭頭所示）的脊索前板；H：75%外包期（8h），箭頭示腹側(cè)薄的排泄區(qū)；I：80%外包期（）背側(cè)觀，箭頭示軸中胚層與中線邊界，近軸中胚層在其一側(cè)；J：90%外包期（9h），在一些胚胎中可見尾芽（箭頭所示）；K：90%外包期腹側(cè)觀，前側(cè)脊索前板（對比G）增大為小膨出；L：尾芽期（10h），箭頭示小膨出，短箭頭示尾芽，尾芽腹側(cè)（即此圖左側(cè)）的顯著區(qū)域顯示外包結(jié)束時卵黃消失處。比例尺=250μm發(fā)育時間（h）外包百分率圖 12. 外包期間胚層邊緣覆蓋卵黃前行的速率理想曲線（℃）。外包百分率指的是被胚層覆蓋的胚胎（胚層加卵黃細胞）占整體的份額。，其速率相對恒定，約為每小時外包15%。我們觀察了一起發(fā)育的多組胚胎（每組約12個）而獲得這些數(shù)據(jù)，此處忽略了胚胎中可能的變異。 作為形態(tài)發(fā)生運動，胚層邊緣的內(nèi)卷似乎很好地證明了一種硬骨魚玫瑰無須鲃（rosy barb）的發(fā)育在很多方面與斑馬魚極為相似（Wood and Timmermans, 1988）。 Trinkaus 最近獲得了一些資料（尚未發(fā)表）證明克鯉魚的胚胎根本不發(fā)生內(nèi)卷，相反，近于表面的細胞獨自由表面向深部遷移，而不是以整個細胞層進行卷動。這一運動稱內(nèi)移運動（ingression），也可能在斑馬魚中發(fā)生（J. Shih and . Fraser，尚未發(fā)表），這是用高分辨率的時滯分析對Wood和Timmermans曾觀察過的整個細胞野做進一步研究所得。隨著細胞向內(nèi)運動，一條裂溝稱Brachet裂縫在Nomarski光鏡下開始變得可見（圖13），在橫斷面位于上下胚層之間。我們在75%外包期的圖1中指出了這一裂縫的所在，但用立體顯微鏡常不易定位（對比圖11和13）。正常情況下，胚層的細胞不會跨過Brachet裂縫進行融合（不過實驗條件下可能，見下文）。兩胚層內(nèi)的細胞以各自不同的方向進行流動。除背側(cè)區(qū)域（見下文），上胚層通常向外側(cè)流動，而達到外圍后又向內(nèi)運動進入下胚層。然后，作為下胚層細胞游離外圍（Warga and Kimmel, 1990）。原腸期結(jié)束時仍留在上胚層的細胞相當于最后的外胚層（ectoderm），將產(chǎn)生諸如表皮、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)嵴以及感受基板等組織。而下胚層將產(chǎn)生中胚層（mesoderm）和內(nèi)胚層（endoderm），Thisse等（1993）稱之為“內(nèi)中胚層”（“mesendoderm”）。兩個名稱都強調(diào)了在原腸期的任一分期都不存在三個獨立的胚層，只有兩個。環(huán)繞大部分胚胎周圍的下胚層此時只有一兩層細胞厚（圖13），目前尚不知其何以分化成內(nèi)胚層和中胚層。圖 13 . 原腸中期胚胎的背側(cè)胚層，75%外包期，Nomarski光鏡。我們將胚胎植物極朝上，輕輕平放于兩蓋玻片之間，再聚焦，大致在動植物極中線處獲得此光學剖面圖。因而，此圖是沿胚軸觀察而得，中心為中線結(jié)構(gòu)。上面的細胞中胚層覆蓋下面的卵黃細胞。EVL在此期極薄，不可見（但在表面觀可見）。箭頭示上下胚層的顯著邊界Brachet裂縫。上胚層似為厚度幾乎均一的多層細胞，但實際上此時它可能正在形成單細胞層的假層上皮（pseudostratified epithelium，Papan and CamposOrtega, 1994）。下胚層夾在上胚層和YSL之間。遠離背中線（例如箭頭附近區(qū)域）近軸中胚層似為單層立方細胞。特別在中線區(qū)域Brachet裂縫較不明顯，軸下胚層增厚，可能包含不止一層細胞。隨后，軸下胚層將同時貢獻于中胚層（如脊索）和內(nèi)胚層。比例尺=50μm在4h時的球形期EVL發(fā)生世系限制之后的約1小時，許多DEL細胞（并非全部）也有了世系限制，將發(fā)育為某個組織或特定的器官。世系限制發(fā)生于原腸期開始時（Kimmel and Warga, 1987。 Kimmel et al., 1990b, 1994）。與早期EVL世系限制不同的是，原腸早期DEL細胞的世系限制并不伴隨細胞的定型（Ho and Kimmel, 1993）：如果將DEL細胞逐一從通常產(chǎn)生中胚層和內(nèi)胚層的外圍區(qū)域移植到通常形成外胚層的動物極區(qū)域，它會同時改變其形態(tài)和發(fā)育方向，與其周圍的細胞沒有區(qū)別。發(fā)育調(diào)節(jié)的能力可能包括合子表達模式基因（zygotically expressed patterning genes）活動的動態(tài)調(diào)節(jié)：外圍細胞特異性