【文章內(nèi)容簡介】 。比如，近年來大分子分離技術(shù)、產(chǎn)品以及工藝相關(guān)技術(shù)大大改進，生產(chǎn)商在建立產(chǎn)品和生物活性表征方面經(jīng)驗證的靈敏方法以及對這些檢測中差異顯著性評價方面所具有的能力，有能力在不必重復(fù)進行臨床藥效研究的情況下，對產(chǎn)品可比性研究進行評價。如果可比性試驗證明生產(chǎn)變更并未對產(chǎn)品的安全性、特性、純度和效價產(chǎn)生影響，可認為這兩種產(chǎn)品具有可比性?？杀刃匝芯渴菑S房變更的關(guān)鍵，本文嘗試以注射用重組人生長激素新建廠房的可比性研究為例，對如何評價產(chǎn)品變更前后的可比性進行探討。第3章 注射用重組人生長激素產(chǎn)品介紹藥品的安全性和有效性是通過上市前非臨床和臨床試驗而評價，藥品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性通過臨床期間的藥學(xué)研究而最終確定的，因此對于已上市產(chǎn)品的變更，其關(guān)鍵質(zhì)量屬性不應(yīng)發(fā)生變更，否則需要追加非臨床或臨床試驗來確認其安全性和有效性。注射用重組人生長激素產(chǎn)品已上市10多年，歐洲藥典、美國藥典和中國藥典均收錄了此產(chǎn)品，具有比較成熟的分析方法，質(zhì)量標準也是基于對產(chǎn)品和工藝的了解而建立的，因此質(zhì)量標準反映了其關(guān)鍵質(zhì)量屬性。下面從原液、半成品和成品3個方面分別介紹新車間產(chǎn)品的研究方法和質(zhì)量標準。 原液的研究方法和質(zhì)量標準重組人生長激素的關(guān)鍵質(zhì)量屬性包括一級、二級和三級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、免疫化學(xué)性質(zhì)、生物活性、純度和雜質(zhì)以及產(chǎn)品的穩(wěn)定性，原液的研究方法應(yīng)包含上述內(nèi)容。 重組人生長激素的結(jié)構(gòu)圖 3給出了人生長激素的一級氨基酸序列和二硫鍵位置。圖 3人生長激素一級結(jié)構(gòu)圖[42]重組人生長激素的分子式為C990H1528N262O300S7，分子量22125道爾頓。其他結(jié)構(gòu)信息列于表4中。新車間重組人生長激素原液應(yīng)進行結(jié)構(gòu)的確證，證明其和天然的人生長激素的結(jié)構(gòu)具有一致的一級和二級結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)確證檢測包括：肽圖質(zhì)譜覆蓋率、質(zhì)譜分子量、N末端和C末端序列檢測、二硫鍵配對檢測和圓二色譜法檢測。兩個車間各取1~3批原液進行結(jié)構(gòu)檢測，表4列出了檢測項目和兩個車間原液結(jié)構(gòu)的一致性評價標準。表4人生長激素結(jié)構(gòu)確證研究內(nèi)容檢測項目理論值一致性標準質(zhì)譜分子量22,125Dalton3批原液檢測，分子量和理論值誤差小于1%；和對照品平均分子量相差小于20Dalton肽圖質(zhì)譜覆蓋率氨基酸序列兩種酶酶切，分子量覆蓋率應(yīng)大于90%圓二色譜法alfa螺旋占多數(shù)相同條件檢測，應(yīng)和對照品譜圖一致二硫鍵配對兩對二硫鍵：Cys53Cys165和Cys182Cys189僅有C53C165和C182和C189兩對分子內(nèi)二硫鍵，沒有錯配和分子間二硫鍵N末端序列NH2FPTIPLSRLFN末端10個殘基序列為NH2FPTIPLSRLFC末端序列SVEGSCGFCOOHC末端8個殘基序列為SVEGSCGFCOOH 放行標準注射用重組人生長激素產(chǎn)品已上市10多年，并且是在《中華人民共和國藥典》中有收錄，因此質(zhì)量標準反映了其關(guān)鍵質(zhì)量屬性，下面從原液、半成品和成品3個方面分別介紹新車間產(chǎn)品的研究方法和質(zhì)量標準。 原液的研究方法和質(zhì)量標準重組人生長激素的關(guān)鍵質(zhì)量屬性包括一級、二級和三級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、免疫化學(xué)性質(zhì)、生物活性、純度和雜質(zhì)，以及產(chǎn)品的穩(wěn)定性，因此原液的研究方法應(yīng)從上述方面進行。 重組人生長激素的結(jié)構(gòu)圖 3給出了人生長激素的一級氨基酸序列和二硫鍵位置。圖 4人生長激素一級結(jié)構(gòu)圖[]重組人生長激素的分子式為C990H1528N262O300S7，分子量22125道爾頓。其他結(jié)構(gòu)信息列于表4中。新車間重組人生長激素原液，應(yīng)進行結(jié)構(gòu)的確證，證明其和天然的人生長激素的結(jié)構(gòu)具有一致的一級和二級結(jié)構(gòu)。兩個車間各取1~3批原液進行結(jié)構(gòu)檢測，檢測包括：肽圖質(zhì)譜覆蓋率、質(zhì)譜分子量、N末端和C末端序列檢測、二硫鍵配對檢測和圓二色譜法檢測。表4列出了這些檢測的理論值和兩個車間原液結(jié)構(gòu)的一致性評價標準。表5人生長激素結(jié)構(gòu)確證研究內(nèi)容檢測項目理論值一致性標準質(zhì)譜分子量22,125Dalton3批原液檢測，分子量和理論值誤差小于1%；和對照品平均分子量相差小于20Dalton肽圖質(zhì)譜覆蓋率氨基酸序列兩種酶酶切，分子量覆蓋率應(yīng)大于90%圓二色譜法alfa螺旋占多數(shù)相同條件檢測，應(yīng)和對照品譜圖一致二硫鍵配對兩對二硫鍵：Cys53Cys165和Cys182Cys189僅有C53C165和C182和C189兩對分子內(nèi)二硫鍵，沒有錯配和分子間二硫鍵N末端序列NH2FPTIPLSRLFN末端10個殘基序列為NH2FPTIPLSRLFC末端序列SVEGSCGFCOOHC末端8個殘基序列為SVEGSCGFCOOH 放行標準新車間重組人生長激素原液不僅應(yīng)符合放行檢驗標準，還應(yīng)基于收集的歷史數(shù)據(jù)，通過統(tǒng)計學(xué)方法建立兩個車間比較的驗收標準。根據(jù)分析方法的性質(zhì)，可以將放行標準分為定量標準和定性標準，定性標準作為定量標準的補充，更全面的展現(xiàn)產(chǎn)品雜質(zhì)增減情況。重組人生長激素主要相關(guān)雜質(zhì)有：脫氨組分、氧化組分、多聚體、工藝中被截斷的人生長激素片段。主要工藝雜質(zhì)有：內(nèi)毒素、宿主菌體蛋白、外源DNA、微生物。內(nèi)控放行標準的檢測方法涵蓋了上述雜質(zhì)的分析。因此可以通過對放行檢測結(jié)果的比較，證明廠房的變更對原液的理化性質(zhì)、純度和雜質(zhì)是否產(chǎn)生了不利影響。新車間采用至少10批次原液和老車間進行比較，原液應(yīng)符合放行標準，同時對定量檢測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，比較兩個車間的平均值和標準偏差，判斷兩者是否有顯著差異。表 6列出了主要的放行標準檢測項目，檢測方法基本是藥典方法，分析方法可靠并均經(jīng)過驗證。表 6 重組人生長激素原液的放行標準檢測項目分析方法外觀目檢鑒別方法（1）《中華人民共和國藥典》二部重組人生長激素項下的鑒別（1）項方法（反相色譜法）方法（2）《中華人民共和國藥典》二部重組人生長激素項下的鑒別（4）項方法（等電聚焦電泳IEF）檢查相關(guān)蛋白《中華人民共和國藥典》二部注射用重組人生長激素項下的相關(guān)蛋白檢測方法（反相色譜法）高分子蛋白《中華人民共和國藥典》二部注射用重組人生長激素項下的高分子蛋白檢測方法（分子排阻色潽法）電荷異構(gòu)體等電聚焦電泳細菌內(nèi)毒素《中華人民共和國藥典》二部附錄XI E殘余宿主蛋白《中華人民共和國藥典》二部重組人生長激素項下的菌體蛋白殘余量檢測方法DNA殘留《中華人民共和國藥典》二部重組人生長激素項下的外源性DNA殘留量下的方法含量《中華人民共和國藥典》二部注射用重組人生長激素項下方法 生物學(xué)活性《中華人民共和國藥典二部》附錄XII P生長激素生物測定法是采用去垂體大鼠體重法和脛骨法進行的生物活性測定法，和生長激素的體內(nèi)藥效學(xué)研究采用相同的方法，因此去垂體大鼠體重法和脛骨法測定結(jié)果也反映了動物體內(nèi)藥效結(jié)果?！吨腥A人民共和國藥典二部》重組人生長激素各論中規(guī)定生物活性：照生長激素生物測定法（附錄XII P）依法檢查，（每年至少測定一次）。兩個車間各取1~3批同時進行重組人生長激素體內(nèi)生物學(xué)活性的檢驗，兩個車間原液的生物活性應(yīng)符合《中華人民共和國藥典》重組人生長激素各論中的規(guī)定，兩者的活性平均值和標準偏差應(yīng)沒有顯著差異，以此證明廠房的變更未改變其體內(nèi)生物學(xué)活性。 免疫化學(xué)性質(zhì)免疫化學(xué)性質(zhì)的檢測可以采用免疫斑點法或western blot方法，兩種方法均針對重組人生長激素的抗原特性進行檢測。免疫化學(xué)性質(zhì)的研究，可以證明兩個車間生產(chǎn)的原液抗原特異性一致性，它的一致性可以進一步說明兩者結(jié)構(gòu)的一致。 強制降解試驗和長期穩(wěn)定性新車間生產(chǎn)的原液可以通過高溫和光照強制破壞試驗，檢測相關(guān)蛋白、高分子蛋白質(zhì)、電荷異構(gòu)體、含量，比較兩者之間降解物和降解速率。在工藝不變的情況下降解產(chǎn)物類型和降解速率應(yīng)該沒有顯著變化，新車間原液和老車間強制降解比較應(yīng)不得產(chǎn)生新的降解產(chǎn)物。重組人生長激素原液為冷凍保存，因此無需進行加速穩(wěn)定性考察，僅進行長期穩(wěn)定性考察。將新車間和老車間的長期穩(wěn)定性歷史數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和比較，降解速率和雜質(zhì)類別上應(yīng)沒有明顯的差異。重組人生長激素原液長期穩(wěn)定性考察方法如下：擬考察點為0、11236個月。原液包裝形式和老車間一致，貯存溫度2~8℃。按照《中國藥典》2010年版附錄XIX C“原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則”，本品為注射劑，指導(dǎo)原則規(guī)定的重點考察項目為：外觀色澤、含量、pH值、可見異物、有關(guān)物質(zhì)。因此重點考察項目為：性狀、含量、pH值、可見異物、有關(guān)物質(zhì)（相關(guān)蛋白、高分子蛋白）、水分指標。在0、24和36個月進行全項檢測。 半成品的研究方法和質(zhì)量標準重組人生長激素原液和輔料按照處方比例進行混合后除菌過濾得到半成品。半成品的放行標準包括：內(nèi)毒素、無菌、蛋白含量。新車間半成品應(yīng)符合放行標準，和歷史數(shù)據(jù)比較沒有顯著差異。半成品除放行標準的檢測還應(yīng)增加穩(wěn)定性考察，在室溫下，考察0、16和24小時半成品相關(guān)蛋白、高分子蛋白和含量，新車間半成品在考察期內(nèi)應(yīng)符合成品的放行標準，比較兩個車間上述指標平均值和相對標準偏差，兩個車間應(yīng)無顯著差異。 成品的研究方法和質(zhì)量標準注射用重組人生長激素已經(jīng)被錄入《中華人民共和國藥典》，因此其放行標準是不低于《中華人民共和國藥典》2010年版的各論的要求，放行檢測涵蓋了注射用重組人生長激素理化性質(zhì)、純度和雜質(zhì)、生物學(xué)活性等產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性。可以作為評價兩個車間產(chǎn)品質(zhì)量的比較標準。新車間注射用重組人生長激素的研究，不僅要求符合放行標準，還應(yīng)進行生物活性和穩(wěn)定性考察。新車間至少3個連續(xù)批和老車間進行比較，比較方法如下：l 半成品和成品放行檢測中的定量項目應(yīng)采用統(tǒng)計分析的方法和老車間的歷史數(shù)據(jù)比較，比較平均值，相對標準偏差。l 兩個車間同期生產(chǎn)的產(chǎn)品均應(yīng)符合質(zhì)量標準。l 對兩個車間同期生產(chǎn)的產(chǎn)品雜質(zhì)進行分析，應(yīng)沒有新增雜質(zhì)的出現(xiàn)。l 兩個車間的產(chǎn)品同時進行高溫和光照的強制降解試驗，比較兩個車間產(chǎn)品在高溫和光照情況下降解速率是否有不同，雜質(zhì)類型是否有差異。l 新車間連續(xù)3批產(chǎn)品進行加速穩(wěn)定性考察，采用市售小包裝貯存，溫度25℃177。2℃，濕度60%177。5%。參照《中國藥典》2005年版附錄XIX C《原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則》以及《化學(xué)藥物穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》設(shè)置考察時間點，考察點為0、重點考察項目為：性狀、含量、pH值、可見異物和有關(guān)物質(zhì)（相關(guān)蛋白和高分子蛋白）。0和6個月進行全項檢測。新車間和老車間產(chǎn)品的歷史數(shù)據(jù)進行比較，兩者在降解速率和雜質(zhì)類別上應(yīng)沒有明顯的差異。l 新車間每個規(guī)格至少3批進行長期穩(wěn)定性考察，采用市售小包裝貯存，貯存溫度5℃177。3℃。按照《中國藥典》2005年版附錄XIX C《原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則》以及《化學(xué)藥物穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》設(shè)置考察時間點。時間點在第一年一般為每3個月末一次，第二年每6個月末一次，以后每年末一次。即第0、11236個月末取樣檢測考察指標。重點考察項目為：性狀、含量、pH值、可見異物和有關(guān)物質(zhì)（相關(guān)蛋白和高分子蛋白）。0、24和36個月分別進行全項檢測。和老車間同規(guī)格產(chǎn)品進行比較，兩者在穩(wěn)定性上應(yīng)沒有明顯差異。表7注射用重組人生長激素放行標準檢測方法檢測項目分析方法外觀目檢鑒別方法（1）《中華人民共和國藥典》二部重組人生長激素項下的鑒別（1）項方法（反相色譜法）方法（2）《中華人民共和國藥典》二部重組人生長激素項下的鑒別（4）項方法（等電聚焦電泳IEF）檢查水分費休氏法容量滴定法相關(guān)蛋白《中華人民共和國藥典》二部注射用重組人生長激素項下的相關(guān)蛋白檢測方法（反相色譜法）高分子蛋白《中華人民共和國藥典》二部注射用重組人生長激素項下的高分子蛋白檢測方法（分子排阻色潽法）電荷異構(gòu)體等電聚焦電泳異常毒性《中華人民共和國藥典》二部附錄XI C細菌內(nèi)毒素《中華人民共和國藥典》二部附錄XI E裝量差異《中華人民共和國藥典》二部附錄I B注射劑無菌《中華人民共和國藥典》二部附錄XI H 薄膜過濾法酸堿度《中華人民共和國藥典》二部附錄 VI H溶液的澄清度與顏色《中華人民共和國藥典》二部附錄IX A第一法和附錄IX B可見異物《中華人民共和國藥典》二部附錄IX H燈檢法不溶性微?！吨腥A人民共和國藥典》二部附錄IX C第一法含量《中華人民共和國藥典》二部注射用重組人生長激素項下方法生物學(xué)活性《中華人民共和國藥典》二部重組人生長激素項下方法第4章 初步風(fēng)險評估 輸入物料的變更分析和風(fēng)險評估根據(jù)圖 2的工藝流程圖，首先對注射用重組人生長激素工藝中的輸入物料分別進行分析，找出由于廠房變更而引起變化的輸入物料，然后針對這些輸入物料進行變更的風(fēng)險識別和評估。表8將注射用重組人生長激素的全部輸入物料列出，并對可能引起變化的物料進行了識別。表8輸入物料的變更分析物料名稱是否變更風(fēng)險分析細胞庫（MCB和WCB）否生物制品的起始物料，是關(guān)鍵物料，由于在原址增建車間，因此種子批采用和原車間相同的種子批，需規(guī)定采用相同的轉(zhuǎn)運方式。發(fā)酵培養(yǎng)基否半合成培養(yǎng)基，是關(guān)鍵物料，來源和質(zhì)量標準和原車間一致。儲存和稱量的地址均未變化。各種鹽否初純和精純使用了各種鹽，如作為緩沖劑的磷酸鹽等，這些化學(xué)物料的來源、質(zhì)量標準未發(fā)生變化，檢測、儲存和稱量地址均無變化。層析介質(zhì)否層析介質(zhì)是關(guān)鍵物料，來源和種類對分離影響很大，因此是不能變更的。采用和原車間一致的采購、質(zhì)控、存儲。過濾膜否過濾膜的來源、材質(zhì)非常重要，不能變更。采用和原車間一致的采購、質(zhì)控、存儲。工藝空氣是工藝空氣和產(chǎn)品接觸的單元操作主要是發(fā)酵和除菌過濾。發(fā)酵需要通氣保持溶氧。過濾是通過氣壓使半成品濾過除菌過濾膜。工藝空氣系統(tǒng)進行了改造，涉及到變更，風(fēng)險較高需要進行全面驗證。純化水是發(fā)酵和初純采用純化水，因為大腸桿菌的發(fā)酵相對對水的要求沒有細胞培養(yǎng)高，同時大腸桿菌本身產(chǎn)生