產(chǎn)綠原酸金銀花內(nèi)生菌的分離研究論文(編輯修改稿)
2025-07-15 12:49 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 參照《2010版藥典》進(jìn)行測定，色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈：%磷酸溶液（13：87）為流動相；流速1ml/min；柱溫25℃；檢測波長327nm；進(jìn)樣量10181。L，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于1000。 內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定 傳統(tǒng)鑒定方法本實驗對于內(nèi)生真菌進(jìn)行了初步的的形態(tài)鑒定，主要通過觀察其孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、產(chǎn)孢方式等來進(jìn)行，目前主要對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，方法如下：挑取純化的真菌菌絲，分別接種于PDA和察氏培養(yǎng)基上，采用3點接種法培養(yǎng)，肉眼觀察菌落正反面特征；采用插片培養(yǎng)法對孢子進(jìn)行顯微觀察。參照《真菌鑒定手冊》進(jìn)行鑒定，可將內(nèi)生菌初步鑒定到屬水平。如果更加準(zhǔn)確的鑒定需要做分子生物方面的研究，由于時間的限制，未對菌株做分子生物學(xué)方面的實驗。 分子生物學(xué)鑒定方法傳統(tǒng)的內(nèi)生菌鑒定方法過于繁瑣和復(fù)雜，而微生物的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征是有其內(nèi)部的核酸分子所決定的，因此對篩選得到的菌株，通過對內(nèi)生菌ITS rDNA 序列的分析進(jìn)行鑒定，并利用DNA man 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定內(nèi)生菌已經(jīng)成為菌種鑒定的主要方法。 二次發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 固體基本培養(yǎng)基的選擇將菌株B415接種于PDA平板上，28℃，倒置培養(yǎng)，待菌落生長為培養(yǎng)皿1/3時，用無菌打孔器沿著菌落邊緣打取相同大小的菌餅，直徑為5mm，分別轉(zhuǎn)接至各種供試固體培養(yǎng)基上。置恒溫培養(yǎng)箱中，28℃，倒置培養(yǎng)。以菌落的生長速度及長勢為指標(biāo)，選擇最適合于菌株生長的固體培養(yǎng)基。 液體基本培養(yǎng)基的選擇制備菌株種子液，并以10%接種量接入到下列液體培養(yǎng)基中：玉米粉葡萄糖培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基，28℃,120r/min搖床培養(yǎng)至菌球分散均勻。培養(yǎng)結(jié)束后，測定菌株B415的菌絲干重；將發(fā)酵液進(jìn)行提取，利用高效液相測定綠原酸含量，從而確定最佳液體培養(yǎng)基。 發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化碳源的選擇以選擇出的最適液體培養(yǎng)基為測定碳源的基本培養(yǎng)基，分別以以下碳源代替培養(yǎng)基中的碳源：葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖。培養(yǎng)條件及測定方法同液體培養(yǎng)基的選擇一致。氮源的選擇以選擇出的最適液體培養(yǎng)基為測定氮源的基本培養(yǎng)基，供試氮源分別為硝酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、尿素，培養(yǎng)條件及測定方法同液體基本培養(yǎng)基的選擇一致。溫度的選擇已選擇出的最適液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別在26℃、28℃、30℃、32℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件及測定同上。 發(fā)酵條件的正交試驗發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化只能客觀評價培養(yǎng)基中各成分所起的作用，而對于培養(yǎng)基整體而言還需要做下一步的實驗工作，接下來會以菌株中綠原酸含量為指標(biāo)，進(jìn)行發(fā)酵條件的正交實驗，優(yōu)選最佳的碳源、氮源濃度和最佳培養(yǎng)溫度。以上述試驗選擇的碳源、氮源、溫度、pH值這4個因素分別選取3個水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗，在最適溫度下進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵試驗，正交試驗各因素及水平見表1：表2 正交試驗因素水平因素水平123A 碳源濃度%2%%B 氮源濃度%%%C pH%%%D 溫度26℃28℃30℃ 金銀花內(nèi)生真菌的抑菌實驗將3株內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落生長為培養(yǎng)皿1/3，7mm打孔器打取菌餅轉(zhuǎn)接至PDB培養(yǎng)液中發(fā)酵，搖床120r/min，28℃恒溫培養(yǎng)96小時，將發(fā)酵液10000r/min離心10min，取上清液至小瓶中備用。抑菌活性測試采用紙片擴(kuò)散法：將金銀花內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物分別配成1mg/mL的甲醇溶液，然后去50181。L的各菌株次生代謝產(chǎn)物溶于小濾紙片，使其充分吸收，平方與分別含有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的瓊脂水培養(yǎng)基上，每株真菌對3中測試菌分別作3個重復(fù)，金銀花提取液作為陽性對照。將制好的培養(yǎng)皿在37℃恒溫培養(yǎng)24小時后觀察，測定其抑菌圈大小。4 結(jié)果與分析 菌株篩選的結(jié)果將金銀花不同組織部位（根、莖、葉、花）先在自來水下沖洗干凈，去除表面的泥土與灰塵，無菌濾紙吸干表面水分，然后按照以上程序進(jìn)行表面消毒。表3 金銀花不同組織的內(nèi)生真菌種類及分布部位菌株數(shù)（株）涉及屬的數(shù)目（株）占總菌株數(shù)的比例涉及屬占總屬數(shù)的比例根214%%莖257%%葉174%%花135%%總計799100%100%通過對金銀花內(nèi)生真菌的分離，共得到內(nèi)生真菌79株，其中從金銀花根部分離得到21株，%；從莖部分離得到25株，%；從葉片中分離得到17株，%；花蕾中分離得到13株，%。由此可知金銀花莖中內(nèi)生真菌種類豐富，其次為根和莖，花中內(nèi)生真菌數(shù)量最少。本實驗表明了在健康的金銀花組織中存在著豐富的內(nèi)生真菌，而其種類與數(shù)量則與其分離部位有關(guān)。 菌株次生代謝產(chǎn)物檢測結(jié)果 薄層色譜法(TLC)檢測 采用薄層色譜法進(jìn)行初選，篩選出的三個菌株的次生代謝產(chǎn)物疑似綠原酸，三株菌株與綠原酸對照品具有相同的Rf值。薄層層析圖譜如下：圖1 三株菌株發(fā)酵液薄層色譜圖A:A324，B:B415，C:B431,D:綠原酸對照品，E：金銀花提取液Rf值：A:, B:, C:, D:, E: 高效液相色譜法(HPLC)檢測采用高效液相色譜法進(jìn)一步確認(rèn)：三株內(nèi)生真菌A324，B415，B431與綠原酸對照品保留時間相近。三株菌株發(fā)酵液與綠原酸品液相色圖譜如下： 圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)酵液液相色譜圖6號峰。圖3 菌株A324發(fā)酵液液相色譜圖15號峰。圖4 菌株B415發(fā)酵液液相色譜圖14號峰。圖5菌株B431發(fā)酵液液相色譜圖12號峰。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：通過改變進(jìn)樣體積，得到不同進(jìn)樣量X下的峰面積Y，進(jìn)而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=222428x88456,R2=。表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表5 三株內(nèi)生真菌發(fā)酵液綠原酸含量計算液相編號保留時間/min峰面積含量（μg/ml）標(biāo)準(zhǔn)品A324B415B231
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