【文章內(nèi)容簡介】 因工程菌株，從而應(yīng)用于葡萄糖異構(gòu)酶的大規(guī)模生產(chǎn)。國內(nèi)自六十年代起已開展了葡萄糖異構(gòu)酶應(yīng)用于果葡糖漿生產(chǎn)的研究，山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院通過誘變篩選獲得的 7 號淀粉酶鏈霉菌 M1033 菌株，是國內(nèi)在這方面最具應(yīng)用價(jià)基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目資金申請報(bào)告.值的工業(yè)菌之一。目前國內(nèi)外主要是通過誘變篩選等手段來獲得生產(chǎn)用菌株，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院是國內(nèi)唯一開展葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程的研究單位，并對葡萄糖異構(gòu)酶的催化機(jī)理及其蛋白質(zhì)工程進(jìn)行了多年的研究和探索。經(jīng)十余年科技攻關(guān)目前已完成葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程改造，獲得性質(zhì)改良的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶；并利用基因工程方法構(gòu)建表達(dá)量極高的基因重組鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株，獲得了具有完整自主知識產(chǎn)權(quán)的同源重組基因工程菌 M1033WZ。所建立的葡萄糖異構(gòu) 酶蛋白質(zhì)工程研究系統(tǒng)在完整性和有效性上都達(dá)到國際先進(jìn)水平，在國內(nèi)處于領(lǐng)先水平。在該課題的研究過程中，項(xiàng)目組在國內(nèi)外知名刊物發(fā)表學(xué)術(shù)論文十余篇（附件 415，416），并獲得安徽省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)進(jìn)步獎及安徽省優(yōu)秀論文獎（附件 417）。第一節(jié) 成果來源及知識產(chǎn)權(quán)情況中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院獨(dú)立承擔(dān)國家“八六三” 項(xiàng)目“ 葡萄糖異構(gòu) 酶的蛋白 質(zhì)工程” （附件 414），歷經(jīng)十余年聯(lián)合科技攻關(guān)目，前已完成葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程改造，獲得性質(zhì)改良的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶；并利用基因工程方法構(gòu)建高表達(dá)量的基因重組鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株，獲得了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目資金申請報(bào)告.同源重組基因工程菌 M1033WZ。中國科學(xué)技 術(shù)大學(xué)根據(jù)學(xué)校知識產(chǎn)權(quán)管理規(guī)定，經(jīng)慎重研究，決定將基因重組葡萄糖異構(gòu)酶技術(shù)所有權(quán)作價(jià) 175 萬元人民幣作為學(xué)校投資投入中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實(shí)業(yè)總公司。 （見附件 411）2022 年 2 月 28 日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實(shí)業(yè)總公司以合資成立安徽*****生物技術(shù)有限公司補(bǔ)充協(xié)議的形式，將基因重組葡萄糖異構(gòu)酶技術(shù)以 177 萬元人民幣的價(jià)格向合資公司轉(zhuǎn)讓，其中 50 萬元按國家及學(xué)校有關(guān)政策獎勵給相關(guān)技術(shù)團(tuán)隊(duì)成員。轉(zhuǎn)讓后，基因重組葡萄糖異構(gòu)酶技術(shù)的所有權(quán)歸安徽*****生物技術(shù)有限公司所有。 （見附件 41附件 413）第二節(jié) 已完成研究開發(fā)工作及鑒定、中試情況一、背景資料葡萄糖異構(gòu)酶（Glucose Isomerase，簡稱 GI）結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是國際上公認(rèn)的研究酶的催化機(jī)制及建立蛋白質(zhì)工程技術(shù)的最好模型之一。利用基因工程和蛋白質(zhì)工程的方法改造野生型葡萄糖異構(gòu)酶不僅具有理論研究意義而且具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在異構(gòu)化反應(yīng)中，溫度提高，熱力學(xué)平衡趨向于果糖方面，因此提高野生型葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性可以增加反應(yīng)平衡過程中果糖的產(chǎn)量，從而降低投入酶量，簡化工藝流程，提高經(jīng)濟(jì)效益?；蛑亟M葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目資金申請報(bào)告.基因的同源重組技術(shù)（homologous rebination），又稱基因打靶（gene targeting），指外源 DNA 與受體 細(xì)胞染色體 DNA 上的同源序列之間發(fā)生重組并整合在預(yù)定位點(diǎn)上，從而改變細(xì)胞遺傳特性的方法。根據(jù)重組后靶基因的特征可以分為兩種類型：由于外源序列的引入或部分取代，靶基因原有結(jié)構(gòu)被破壞，此即為基因破壞或剔除（gene disruption or knockout）；靶基因的全部序列為新的基因所取代，即基因置換（gene replacement）。這一新興技術(shù)已被證明為目前能精確的修飾基因組的最有效方法，從理論上講它將使人類能按設(shè)計(jì)對極其復(fù)雜的細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行定點(diǎn)、定量的改變，從而定向的改變細(xì)胞的遺傳結(jié)構(gòu)和特征。本項(xiàng)目在國內(nèi)首次將基因重組技術(shù)應(yīng)用于葡萄糖異構(gòu)酶的研究和生產(chǎn)，其技術(shù)特性及所建立的葡萄糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì)工程研究系統(tǒng)均達(dá)到國際先進(jìn)水平，所獲得的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶適用于果葡糖漿的大規(guī)模生產(chǎn)，將從根本上改變我國葡萄糖異構(gòu)酶生產(chǎn)的落后狀態(tài)。二、成果的專利情況目前項(xiàng)目共獲得 3 項(xiàng)國家發(fā)明專利：“SM33GI 的突變酶GIG138P 及一種提高 GI 熱穩(wěn)定性的突變 方案” （專利號）、“一種葡萄糖異構(gòu)酶的 247 位單突變體酶和138，247 位雙突變體酶及其構(gòu)建方法”（專 利號 ）、“表達(dá) M1033GI 的突變酶 GIG138P 的基因工程菌株 M1033WZ基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目資金申請報(bào)告.及其構(gòu)建方法”(專利號：) ，其中 “表達(dá) M1033GI 的突變酶 GIG138P 的基因工程菌株 M1033WZ 及其構(gòu)建方法”已獲得 PCT 國際專利受理。 （見附件 44444411）三、成果鑒定及中試情況該項(xiàng)技術(shù)在 2022 年 3 月安徽省科技廳組織召開專項(xiàng)科學(xué)技術(shù)成果鑒定會上通過專家評審，認(rèn)為“該課題 采用的技術(shù)方法先進(jìn)，技 術(shù)路線正確，研究成果達(dá)到國內(nèi)領(lǐng)先水平。建議盡快實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。 ”，同時(shí)獲得安徽省科技廳頒發(fā)的科學(xué)技 術(shù)成果鑒定證書（2022 年第 030 號）以及高新技術(shù)成果認(rèn)定證書（2022001 號）。（見附件 443）2022 年 10 月 28 日至 12 月 28 日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院委托蚌埠明星果糖有限責(zé)任公司（原蚌埠果糖廠）進(jìn)行固定化葡萄糖異構(gòu)酶大柱轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，在 68℃轉(zhuǎn)化溫度及 pH 值 條件下， 單柱一次投入成品固定化葡萄糖異構(gòu)酶 93公斤（含水 %），經(jīng)過 60 天轉(zhuǎn)化共計(jì)生產(chǎn)出成品果葡糖漿 噸，平均轉(zhuǎn)化能力為 噸成品果葡糖漿/公斤酶，轉(zhuǎn)化率為 52%。產(chǎn)品的各項(xiàng) 性能指標(biāo)在國內(nèi)屬先進(jìn)水平，可以用于果葡糖漿的大規(guī)模生產(chǎn)。 （見附件 44）基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目資金申請報(bào)告.四、產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)及與國內(nèi)外同類產(chǎn)品比較產(chǎn)品技術(shù)、質(zhì)量指標(biāo)本項(xiàng)目產(chǎn)品將在滿足中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《食品添加劑固定化葡萄糖異構(gòu) 酶制劑》（GB 827487）的基礎(chǔ)上，全面提高葡萄糖異構(gòu)酶各項(xiàng)性能指標(biāo)，并逐步形成企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。產(chǎn)品的主要性能指標(biāo)序號 項(xiàng) 目 理化指標(biāo)1 酶活力（60 目） 6000 單位2 形狀 不規(guī)則桿狀，直徑 3 色澤 棕色4 含水 1218%5 比重 6 膨脹率 倍7 轉(zhuǎn)化能力 噸成品糖漿/公斤成品 酶8 保存性 05℃下保藏 3 個(gè)月，酶活損失 10%左右9 最適 pH 10 熱穩(wěn)定性 最適反 應(yīng)溫度 68℃11 金屬離子影響Cu2+、Fe2+、Ca2+對酶活力 發(fā)揮不力；Mg2+、Co2+可促 進(jìn)轉(zhuǎn)化基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目資金申請報(bào)告.與國內(nèi)、外同類產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)比較本項(xiàng)目產(chǎn)品系國內(nèi)首創(chuàng)，填補(bǔ)國內(nèi)空白，國內(nèi)目前無同類產(chǎn)品。現(xiàn) 將該成果技術(shù)參數(shù)與丹麥諾維信公司的同類產(chǎn)品Sweetzyme174。IT 進(jìn)行比 較如下：序號 指標(biāo)名稱 單位 Sweetzyme174。IT 基因重組葡萄糖異構(gòu)酶1 活力 UGI 3500 60002 熱穩(wěn)定性 ℃ 5560 最適反應(yīng)溫度 68℃3 PH 4 轉(zhuǎn)化能力噸成品糖漿/公斤酶5 第三節(jié) 成果的創(chuàng)新之處本項(xiàng)目是國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目“葡萄糖異構(gòu) 酶的蛋白質(zhì)工程”的重要成果之一，解決了提高葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性和酶活力的難題，并為基因重組葡萄糖異構(gòu)酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，擁有多項(xiàng)我國自主的知識產(chǎn)權(quán)，創(chuàng)新性強(qiáng)，技術(shù)水平高，難度大，許多成果在國際上居于領(lǐng)先地位。根據(jù)查新報(bào)告（見附件 41），本項(xiàng)目的主要創(chuàng)新點(diǎn)和技術(shù)難點(diǎn)如下：雙突變體酶 GI（G138PG247D）的構(gòu)建技術(shù)雙突變體酶的構(gòu)建，使困擾葡萄糖異構(gòu)酶研究和生產(chǎn)領(lǐng)域多基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目資金申請報(bào)告.年的野生型菌株所產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性和酶活力難以充分滿足需要的難題得以解決，為利用基因工程技術(shù)改造葡萄糖異構(gòu)酶創(chuàng)造了條件。這一成就在國際上處于領(lǐng)先地位，并已申報(bào)國家發(fā)明專利。利用基因敲除和置換精確修飾鏈霉菌染色體技術(shù)本項(xiàng)目利用同源重組技術(shù)，把帶有篩選基因的質(zhì)粒片斷的堿變性形式作為同源重組單元引入野生型 M1033 染色體 DNA 的特定片段上，敲除了原有的 GI 基因。再通過雙抗性負(fù)篩選的方法，引入目的基因，并隨染色體 DNA 的復(fù)制而 穩(wěn)定復(fù)制。雙抗性負(fù)篩選（tsr + neo）方法的運(yùn)用首先構(gòu)建帶有neo 抗性的置 換型同源重組質(zhì) 粒，通過neo 抗性的負(fù)篩選來解決鏈霉菌基因置換時(shí)篩選工作量大的問題。由于同源片斷較小，同時(shí)又為了保證較高的轉(zhuǎn)化率，直接將同源重組質(zhì)粒的堿變性形式作為同源重組單元轉(zhuǎn)化缺陷型M1033原生質(zhì)體，獲得插入型同源重組的GI酶活恢復(fù)菌株，再以該菌株為出發(fā)菌株，利用插入型同源重組質(zhì)粒在染色體上的不穩(wěn)定性，通過結(jié)合tsr抗性的負(fù)篩選最終獲得基因置換菌株。此新方法在鏈霉菌染色體研究領(lǐng)域中尚未見報(bào)導(dǎo)。構(gòu)建具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因工程菌株 M1033WZ經(jīng)過十余年的努力構(gòu)建出的具有完整自主知識產(chǎn)權(quán)的基因工程菌株 M1033WZ，現(xiàn)已被中國微生物菌種保藏管理委 員會保藏，是我國利用蛋白質(zhì)工程改造葡萄糖異構(gòu)酶重要成果之一，標(biāo)基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目資金申請報(bào)告.志著我國在這個(gè)領(lǐng)域的研究已經(jīng)跨入世界先進(jìn)行列。 “表達(dá)M1033GI 的突變酶 GIG138P 的基因工程菌株 M1033WZ 及其構(gòu)建方法”已 經(jīng)申請國家 發(fā)明專利，并已獲 得 PCT 國際專利受理。雙突變體的鏈霉菌基因工程菌株 M1033XT 的構(gòu)建運(yùn)用同源重組單交換和雙抗性負(fù)篩選技術(shù)，構(gòu)建出具有雙突變點(diǎn)的 GI（G138PG247D）基因的 7 號鏈霉菌基因工程菌株M1033XT，使 M1033XT 所產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu) 酶的各項(xiàng)主要性能均優(yōu)于野生型 M1033 所 產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶，為發(fā)展我國自己的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)業(yè)，推動我國果葡糖漿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。 該項(xiàng)成果正在申報(bào)國家發(fā)明專利。建立了一套完整的蛋白質(zhì)工程技術(shù)，提高了我國蛋白質(zhì)工程的研究水平鏈霉菌中染色體的分子改造，利用單交換和雙交換模式獲得兩組不同的 M1033GI 缺陷型菌株，再利用基因置 換方法構(gòu)建突變體基因工程菌株，將突變位點(diǎn)精確引入 M1033 染色體中，是葡萄糖異構(gòu)酶領(lǐng)域國際上首次利用基因敲除和置換精確修飾鏈霉菌染色體構(gòu)建基因工程菌株的范例，建立了一套完整的蛋白質(zhì)工程技術(shù)，提高了我國蛋白質(zhì)工程的研究水平?；蛑亟M葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目資金申請報(bào)告.第三章 建設(shè)方案第一節(jié) 項(xiàng)目的產(chǎn)能規(guī)模及建設(shè)的主要內(nèi)容安徽*****生物技術(shù)有限公司年產(chǎn) 300 噸基因重組葡萄糖異構(gòu)酶項(xiàng)目選址為阜陽市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)，建設(shè)嚴(yán)格遵照工程優(yōu)質(zhì)、布局合理、技術(shù)超前、生產(chǎn)環(huán)保的方針進(jìn)行。具體建設(shè)內(nèi)容如下：新征土地 平方米；建設(shè)新型標(biāo)準(zhǔn)廠房 3000 平方米（包括發(fā)酵車間、固定化車間、分裝車間） ；新建與生產(chǎn)相適應(yīng)的動力配套設(shè)施（空壓站、變電所） ；研發(fā)及品控中心樓 1500 平方米，一方面實(shí)施新產(chǎn)品的開發(fā)和新技術(shù)的應(yīng)用研究，另一方面加強(qiáng)對原料、半成品及終端產(chǎn)品進(jìn)行全質(zhì)量檢驗(yàn)和控制；綜合辦公樓 1500 平方米（含經(jīng)營管理，廣告銷售部門，企劃部門等） 。基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目資金申請報(bào)告.第二節(jié) 采用的工藝技術(shù)路線與技術(shù)特點(diǎn)一、工藝技術(shù)來源及先進(jìn)性基因重組葡萄糖異構(gòu)酶的生產(chǎn)主要包括菌種的擴(kuò)培、發(fā)酵、絮凝、脫水、混合、成型、交聯(lián)、干燥、 貯藏等 過程，其工藝技術(shù)及設(shè)備的先進(jìn)性主要體現(xiàn)如下：因置換型鏈霉菌基因工程菌株 M1033WZ 的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了基因重組葡萄糖異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性的提高，從而在工藝上可提高反應(yīng)溫度 10℃左右，進(jìn)而提高果葡糖漿的產(chǎn)量 15%。適合工業(yè)化培養(yǎng)基篩選及中試規(guī)模發(fā)酵；摸索出基因工程菌株 M1033WZ 三級高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方，可以在較大程度上降低生產(chǎn)技術(shù)。固定化葡萄糖異構(gòu)酶的制備，采取自行研制的高分子交聯(lián)劑和戊二醛結(jié)合，可提高固相化酶的通透性和固相化程度，從而進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化能力。目前選用的主體發(fā)酵及自動化控制設(shè)備先進(jìn)合理，與三級高密度發(fā)酵工藝和固相化工藝緊密結(jié)合，可在最大程度上提高產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效益?；蛑亟M葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目資金申請報(bào)告.二、生產(chǎn)工藝流程工藝流程生產(chǎn)過程將嚴(yán)格按照 ISO9000 質(zhì)量管理體系并參照 GMP生產(chǎn)管理體系進(jìn)行生產(chǎn)。其生產(chǎn)工藝流程示意圖如下：（1）菌種：基因工程菌株 M1033WZ；（2）平皿分離：37℃培養(yǎng) 3 天，菌落隆起，周邊白色，中心鉛灰；（3）茄子瓶培養(yǎng)：37℃培養(yǎng) 2 天，孢子長滿后置于冰箱保藏備用；（4）3000 升種子罐培養(yǎng)：培養(yǎng)基加堿液調(diào)至 ，滅菌冷卻后接入 25 個(gè)茄子瓶孢子懸浮液，通氣比 1:，轉(zhuǎn)速 250 轉(zhuǎn)/分鐘，罐壓 ，37℃培養(yǎng) 2022 小時(shí)，至種子萌發(fā)正常，鏡檢無污染；（5）30000 升發(fā)酵罐培養(yǎng)：培養(yǎng)基加堿液調(diào)至 ，滅菌冷卻后移進(jìn)種子液，通氣比 1:，轉(zhuǎn) 速 180 轉(zhuǎn)/ 分鐘，罐基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目資金申請報(bào)告.壓 ，37℃培養(yǎng) 4050 小時(shí)，至鏡檢菌絲無明顯斷裂或自溶；（6）熱處理：先向發(fā)酵罐中加入 600g CoCl26H2O，然后盤管進(jìn)汽升溫至 70℃，保溫 10 分鐘后，速冷卻至水溫；（7）絮凝：用酸調(diào)發(fā)酵液的 pH 至 ，邊攪拌邊加入殼聚糖溶液，至完全絮凝。在 時(shí)，殼聚糖