【文章內(nèi)容簡介】 分層分離。 1. 速度沉降：密度相近但大小不等 2. 等密度沉降平衡：密度不等的物質(zhì) 速度沉降 ? 生物顆粒在一定的密度梯度介質(zhì)中按照各自的沉降系數(shù)（ S）以不同的速度沉降。 ? 必須在沉降最快的生物顆粒到達管底前停止沉降，并將各部分收集 ? 通常在密度較低的介質(zhì)中進行，一般不需要高速離心 ? 牛血清、 Ficoll（聚蔗糖）、白蛋白等 等密度沉降平衡 ? 生物顆粒的在連續(xù)或不連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長時間沉降到與其自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在該處達到平衡，從而將不同密度的生物顆粒分離。 ? 介質(zhì)密度較高，介質(zhì)的最高密度大于分離組分的最大密度，密度具有一定的陡度 ? 離心力比較大，離心時間長 ? Ficoll、 Percoll（細(xì)胞分離液 ）、Metrizamide（甲泛葡胺 ）等 純化不同細(xì)胞器所推薦的梯度和離心條件 縮寫： (NUC)細(xì)胞核； (PMS)大片細(xì)胞膜； (MTT)線粒體； (LYS)溶酶體； (PER)過氧化物酶體； (PMV)細(xì)胞膜小泡； (SER)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)； (RER)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)； (END)核內(nèi)體； (SARCRT)肌質(zhì)網(wǎng)； (NUCMB)核膜； (OUTER MITMB)線粒體外膜； (INNER MITMB)線粒體內(nèi)膜； (HOM)勻漿物； (dc)非連續(xù)； (c)連續(xù)。 特殊細(xì)胞器的提取 膜蛋白的提取 （ 1）膜蛋白的定義：與膜相關(guān)的蛋白，如脂雙分子層嵌入蛋白，也叫跨膜蛋白。膜蛋白占細(xì)胞總蛋白約 30%，在細(xì)胞生命活動中起重要作用（如信號蛋白、黏附蛋白、載體蛋白），許多膜蛋白是藥物作用靶標(biāo)。 （ 2）膜蛋白提取注意點 A、膜蛋白的純度 與膜粘連的細(xì)胞器可能部分分離出來造成假性，故用 KBr溶液或用更多的離液劑進行清洗，可去掉與膜作用不強的非膜蛋白，從而富集膜蛋白。另外膜蛋白通常位于兩相去污系統(tǒng)中相對較豐富的一相。 B、膜蛋白的特性 低豐度、大多偏堿性、難溶于等電聚焦的水相介質(zhì)中。 C、為了從二維電泳凝膠圖譜中分離出膜蛋白，首先必須服從三個條件 a、必須保證膜的脂類環(huán)境，同時要避免過多的脂對 IEF的干擾。 b 、必須以一種可溶的形式（通常是去污劑 蛋白復(fù)合物）從膜中分離出來。 c、所提取的膜蛋白必須在等電聚焦過程中（特別在等電點附近）保持可溶狀態(tài)。 新的去污劑、對疏水蛋白強溶解的裂解液使膜蛋白提取進一步完善，毫克級上樣量的二維電泳設(shè)備提高了分離的可靠性。 核蛋白的提取 （ 1）核基質(zhì)的提取 A、核基質(zhì)定義：非染色體結(jié)構(gòu)蛋白及細(xì)胞核徑向高鹽離子、核酸酶、去污劑抽提所剩的核蛋白網(wǎng)上結(jié)構(gòu)，包括核纖維蛋白、低豐度核蛋白、核內(nèi)核糖核蛋白及 DNA結(jié)合區(qū)。 B、提取步驟： 細(xì)胞核在含 % TritonＸ－ 100和 沖溶液中勻漿數(shù)分鐘 —— 離心去脂類和可溶性蛋白 —— 取沉淀 ,與提取液 4℃ 反應(yīng) 15min —— 離心除可溶性骨架蛋白 ——取沉淀在消化液內(nèi)室溫消化 30min —— 離心得核基質(zhì)蛋白和中間絲 —— 再溶于含 8M尿素的裂解液中 —— 透析除尿素 —— 離心得上清夜即為細(xì)胞核基質(zhì)蛋白。 提取液： 100mM KCl+3mM MgCl2 + % TritonX100+12mM PMSF 消化液： 50mM NaCl+3mM MgCl2 + 100μg/ml DNase I+ 100μg/ml RNase A。 （ 2）核膜蛋白的提取 A、提取方法：核膜蛋白包括膜整合蛋白和多蛋白復(fù)合物， 不能用去污劑提取，通常用分級制備法得到：細(xì)胞核用冰 TP緩沖溶液勻漿 —— 4℃下攪拌 90min、離心（ 1000 g） 30min —— 取沉淀用 緩沖溶液重懸即得核膜蛋白提取液。 B、進一步分級提?。?核膜蛋白提取液 + TritonX100 （終濃度 %）或 NaCl （終濃度 1M ）或 Urea （終濃度 4M） —— 4℃ 震蕩 15min —— 13000rpm離心可得 TX抗性蛋白及 NaCl洗脫蛋白 —— 50000rpm離心可得離液劑抗性物質(zhì) C、常用溶液 TP緩沖溶液： 10mM TrisHCl + 10mM NaH2PO4 + 1mM PMSF+10 μg/ml aprotinin + 10μg/ml leupeptin + 250 μg/ml heparin+ 1mM Na3VO4 + 10mM NaF+400U Benzon uclease 緩沖溶液 : 20mM TrisHCl + Sucrose+5mM MgSO4 + 1mM Na3VO4 + 1mM PMSF + μg/ml aprotinin + 10μg/ml leupeptin 第二章 二維電泳與蛋白質(zhì)分離 ? 一、蛋白質(zhì)的提取與樣品制備 ? 二、二維等電聚焦 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳維等電聚焦電泳 ? 三、膠上蛋白質(zhì)檢測技術(shù) 電泳的概念 ? 帶電顆粒在一定的介質(zhì)中，在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。 ? 影響電泳速度的主要因素： ? 電場強度（ E）： E越高，電泳速度越快 ? 溶液的 pH值： pI和 pH相差越多，帶電越多，電泳速度越快 ? 溶液的離子強度（ I）： I越高，樣品電流越小，電泳速度越慢； I過低，可導(dǎo)致 pH局部變化影響電泳速度 ? 電滲： 介質(zhì)局部電離導(dǎo)致的樣品電泳速度改變 ? 焦耳熱（ Q）： 熱量高，促使溶液揮發(fā)；同時使得電流降低導(dǎo)致電泳速度減慢 生物實驗室常用電泳 ? 支持物分類 ? 濾紙及纖維膜等：玻璃纖維、醋酸纖維等 ? 凝膠： 瓊脂（ agarose）、聚丙烯酰胺凝膠（ PAG） 等 ? 裝置分類 ? 平板式 ? 垂直板式 ? 圓盤式 ? pH連續(xù)性分類 ? 連續(xù) pH ? 非連續(xù) pH：如等電聚焦電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE） ? 聚丙烯酰胺凝膠 （ polyacrylamide gel, PAG ） 由單體 丙烯酰胺 （ acrylamide， Acr） 和交聯(lián)劑 N， N’甲叉雙丙烯酰胺（ N， N’methylenebisacrylamide, Bis） 聚合而成 。 聚丙烯酰胺凝膠有下列特性： (1) 在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好； (2) 化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶； (3) 對 pH和溫度變化較穩(wěn)定； (4) 幾乎無吸附和電滲作用，只要 Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好； (5) 樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達 106g (6) 凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑； (7) 分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。 二維電泳的基本原理 ? 據(jù)蛋白質(zhì)的兩個一級屬性等電點和相對分子量的特異性，將蛋白質(zhì)混合物在第一方向按等電點高低進行等電聚焦分離（ IEF），在第二方向按照分子量大小進行 SDSPAGE分離（十二烷基硫酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳） ? 1st dimension: Isoelectric focusing (charge) ? 2nd dimension: SDSPAGE (size) 二維電泳結(jié)果 ? 二維電泳分離后的蛋白質(zhì)經(jīng)染色（考馬氏亮藍染、銀染、負(fù)染、熒光染色、放射標(biāo)記染色）、通過圖象標(biāo)志掃描存檔，最后顯現(xiàn)的是二維排列的“滿天星”，每個星點代表一個蛋白質(zhì)。最終獲得蛋白質(zhì)相對分子量、等電點和相對豐度三方面的數(shù)據(jù)。 ? 傳統(tǒng)的二維電泳最好條件下 20cm 20cm的膠理論上可分辨 10,000個蛋白點（各個方向 100點），實際上只能 3000個點 . ? 二維電泳得到的實驗結(jié)果并非功能蛋白，事實上由于樣品處理過程中涉及亞基間的二硫鍵還原和烷基化處理，即蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)已