【文章內容簡介】 Eub926R 5’CCGTCAATTCCTTTRAGTTT3’ [11]， 16S rRNA[22]的8~27 bp和926~907 bp。在TRFLP分析時，引物Eub8F的5’端采用6FAM進行熒光標記，引物均由Invitrogen(上海)合成并標記。PCR體系及程序同SSCP分析，每樣品平行做4管，PCR產物混合后用于后續(xù)分析。(1) 喜樹根際真細菌16S rDNA文庫構建及測序將喜樹根際真細菌微生物的PCR產物混合后，采用膠回收試劑盒(上海華舜)純化回收，連接于pMD19T載體（寶生物，大連）中，轉化后采用菌落PCR法[23]快速檢測轉化子中是否已經插入目的片段，當插入頻率80%時，隨機選取100個克隆用于測序。測序采用M13通用引物在ABI3730上進行，正反向各測一個反應，以保證序列測通。采用Sequencher ，應用Clustal W軟件[24]將所有的序列與真細菌界框架序列對齊后，以Phylip軟件包[25]中NJ法繪制進化樹，并分析序列在不同類群中比例。(2) TRFLP圖譜的產生以純化試劑盒(NucleoSpin174。 Extract II，MachereyNagel, Germany)純化PCR產物，并最終溶解于40 μl ddH2O中。按說明書，分別采用內切酶MspI，HhaI和RsaI(Fermentas Inc.，MD USA)消化純化的PCR產物，取1~2 μl烘干后，加1 μl含有內標ROX1000(Applied Biosystems, CA USA)的loading buffer，于95℃變性后上樣。%的聚丙烯酰胺凝膠，1TBE緩沖液，于基因測序儀3700(Applied Biosystems, CA USA)中以3 kV收集3 h，片段的長度和濃度采用GenScan軟件進行分析，同時采用內切酶軟件模擬酶切16S rDNA文庫序列，將序列的長度與GenScan分析結果進行對比，找出TRF所對應的微生物類群。采用SPSS 12軟件(SPSS Inc., IL USA)對MspI產生的TRF圖譜進行主成分分析[20]。2 結果與討論 植株生物量特征喜樹和紫莖澤蘭單獨栽培植株枝繁葉茂，而在混栽體系中，喜樹和紫莖澤蘭植株均受到不同程度的影響，在此狀態(tài)下紫莖澤蘭較短小，葉片稀疏；而喜樹植株相對較矮。對不同生物量進行顯著性統(tǒng)計分析表明，在單獨栽培與混合栽培中喜樹和紫莖澤蘭的基莖均沒有顯著差別，自由度(df)=105；紫莖澤蘭株高在單獨栽培和混合栽培下差別非常顯著(p=，df=105)，而喜樹株高差別也較小(p= ，df=110)；另外，紫莖澤蘭植株干重在混栽和單獨栽培下差別顯著(p=，df=7)，喜樹植株干重未獲得。由此可見，在混栽體系中，紫莖澤蘭的生長，尤其是株高受到了喜樹的嚴重制約。喜樹制約紫莖澤蘭等外來入侵植物的蔓延可能是通過多種不同因素共同作用實現的，如對營養(yǎng)物的競爭、對土壤理化性質的改變或分泌某些抑制物等，然而多數研究均顯示，外來入侵種在營養(yǎng)物吸收、改變周圍生境等能力方面遠遠強于本地生物[2628]，這也是多數外來種入侵成功的重要原因。基于此，進而考慮到喜樹自身的特性及近年來對外來種入侵過程中改變根際微生物群落等方面的成果[48,2629]，認為喜樹對紫莖澤蘭的抑制極有可能是通過分泌喜樹堿等物質影響根際中真核微生物結構來實現的。 土壤中喜樹堿類衍生物的檢測及平板菌落計數三種根際土壤的VSS/177。，表明土壤中生物量較低。 μg/ μg/g的羥基喜樹堿， μg/ μg/g的羥基喜樹堿，而紫莖澤蘭根際土壤中二者均檢測不到。這說明喜樹根系的確能夠分泌喜樹堿類衍生物，并擴散到根際土壤中。圖 1 菌落計數法對喜樹(Ca)、紫莖澤蘭(Ea)和喜樹紫莖澤蘭混栽(CE)根際土壤微生物計數結果Number of microbes (CFU)106g1分別計數103~105稀釋度的微生物菌落，取三稀釋度CFU平均數結果見圖1，誤差線標明了不同稀釋度的最大和最小的CFU數量。分析表明，105 CFU/g，105 CFU/g，105 CFU/g，喜樹的根際表現出了對真菌強烈的抑制作用。分析其原因，是喜樹根際分泌的喜樹堿類衍生物干擾了真核生物DNA的正常復制行為[1]，從而抑制了真菌的增殖，極大的降低了土壤中真菌的數量；在混栽根際中真菌的數量雖然明顯增加，但與紫莖澤蘭根際比較表明，在此環(huán)境下真菌的增殖也受到了喜樹堿的抑制，其數量水平低于紫莖澤蘭正常生長擴散時真菌數量。有研究表明，紫莖澤蘭等外來植物在生物入侵過程中能與根際中微生物相互作用，相互促進，形成獨特而豐富的根際真菌群，從而抑制其它植物的生長，達到入侵的目的[4,5,8]，根據本研究的結果，在喜樹和紫莖澤蘭混栽體系中根際真菌的數量水平明顯降低，喜樹可能通過根際分泌物破壞了紫莖澤蘭正常入侵擴散的根際微生物群落模式，從而制約了混栽體系中紫莖澤蘭植株的過度蔓延。喜樹、106 CFU/g，106 CFU/106 CFU/g，喜樹根際真細菌數量明顯高于紫莖澤蘭和混栽根際，與根際真菌數量呈相反的趨勢，而紫莖澤蘭和混栽體系中真細菌數量水平相差不大。為排除紫莖澤蘭的擴散能夠通過改變真細菌群落結構來實現的可能性，本文又采用TRFLP技術對三種根際中真細菌群落結構進行了分析(見下文)。 總DNA提取及三種根際真核微生物相似性分析試劑盒提取的土壤總DNA無色透明，產率為50~200 μg/g土樣，OD280/OD260=~，濃度659~1549 μg/mL，片段約為23 kb，無降解，無RNA污染。對三種根際中真核微生物群落的SSCP分析圖譜見圖2。結合圖1和圖2表明在單獨栽培的紫莖澤蘭根際中真核微生物的多樣性和數量均高于混栽和喜樹根際，進而也說明喜樹堿類衍生物對絕大多數真核微生物均具有抑制作用，體現了其廣譜性的特征，然而根據對喜樹SSCP圖譜中優(yōu)勢條帶分析表明，仍有部分真核微生物種類，如Meristolohmannia spp.(圖2中●)對喜樹堿類衍生物不敏感。值得注意的是，Termitomyces spp. (圖2中←)類真菌不但對喜樹堿有抗性，而且在三種根際中均是優(yōu)勢類群；紫莖澤蘭根際中多種類群的真核微生物均處于優(yōu)勢狀態(tài).(圖2中○)。PCA分析也說明紫莖澤蘭根際中真核微生物類群同喜樹及混栽相距較遠(圖未給出)。多數研究均表明，外來入侵種能夠顯著改變根際真核微生物的多樣性和功能[4,28]，并且通過對土壤微生物功能的影響達到成功入侵的目的。比較圖2中單獨栽培紫莖澤蘭群落泳道(Ea)和混栽泳道(CE)，并結合紫莖澤蘭在2種栽培體系中生物量的差別，可見喜樹改變了紫莖澤蘭正常入侵時根際土壤真核微生物群落模式，從而制約了紫莖澤蘭的進一步擴散和蔓延的勢頭。圖 2　喜樹(Ca)、紫莖澤蘭(Ea)和二者混栽(CE)中真核微生物的SSCP圖譜○示Ea中獨特的真核微生物條帶及多樣性?！袷綜a中獨特的真核微生物條帶: Meristolohmannia spp.。←示三種根際中都存在的類群: Termitomyces spp.Ea Ca CE●←○←←←←← 三種根際土壤真細菌群落結構相似性及多樣性分析三種根際土壤真細菌群落進行TRFLP分析的部分圖譜見圖3。對圖譜的主成分分析表明除了喜樹根際真細菌圖譜有少許差別外，其余基本相同(圖未給出)。結合計數結果，說明經過20個月的栽培過程中，3種栽培體系并沒有形成各自獨特的真細菌類群，紫莖澤蘭沒有改變真細菌微生物群落的多樣性，而喜樹中真細菌數量升高僅僅在于缺少真核微生物對營養(yǎng)物競爭或分泌物為其提供了更多的食物來源。研究表明外來種入侵過程中，真細菌的多樣性一般會提高[26]，而本研究表明紫莖澤蘭的蔓延并沒有改變真細菌微生物群落的多樣性。于興軍等[8]研究表明了紫莖澤蘭的成功入侵可能是通過改變微生物群落的功能來實現的，而土壤微生物的功能是多種微生物，包括真核類和原核類微生物共同作用實現的，本研究表明這種功能的改變可能來源于真核類微生物群落結構的變化，而非真細菌多樣性的變化。圖 3　對喜樹(Ca)、紫莖澤蘭(Ea)和二者混栽(CE)根際真細菌進行TRFLP分析圖譜(只顯示前200bp)圖內方框中為峰值對應的克隆序列細菌種屬，部分峰無對應序列通過對文庫序列與TRFLP片段的比較，找出了部分TRF對應的序列及相應的種屬(圖3)，從