【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 割等方法獲得單個(gè)細(xì)胞，并直接培養(yǎng)建立純系，這種方法獲得的純系稱為 “ 菌株純 ” 。 ?選擇培養(yǎng)法鑒定突變型與重組型 許多細(xì)菌的突變都與培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分及培養(yǎng)條件有關(guān)。 ? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選、鑒定 —— 選擇培養(yǎng)法。 是根據(jù)菌株在 基本培養(yǎng)基 和 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基 上的生長(zhǎng)表現(xiàn) 差異 將菌株分為原養(yǎng)型 (在基本培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng) )與營(yíng)養(yǎng)缺陷型 (在基本培養(yǎng)基上不能正常生長(zhǎng)，只能在相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng) )，該方法 一次只能檢出一種突變型 。 ? 其它突變類型的篩選、鑒定 —— 對(duì)于其它的突變類型(如溫度敏感型 )，也可以通過(guò)培養(yǎng)條件的選擇培養(yǎng)來(lái)篩選與鑒定。 ? 選擇培養(yǎng)法的缺點(diǎn)： ? 效率不高：一次可鑒定、篩選一種突變型 ? 影印培養(yǎng)法 ： ? 黎德伯格夫婦為高效檢測(cè)、分離混和群體不同突變型設(shè)計(jì)了影印培養(yǎng)法，該方法原理與選擇培養(yǎng)法一致 ? 采用影印法將完全培養(yǎng)基上的單菌落同時(shí)接種到不同 選擇培養(yǎng)基 上，同時(shí)對(duì)所有菌落進(jìn)行選擇，提高鑒定效率 ? 注意： ? 最初的培養(yǎng)基必須是 完全培養(yǎng)基 ，各種突變型都能夠生長(zhǎng) ? 模板接種時(shí)必須采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ缤坎蓟騽澗€法，使培養(yǎng)物菌落之間分開 ? 突變型與重組型的批量篩選方法 影印培養(yǎng)法 （ Lederberg,1952） 細(xì)菌的染色體作圖 接合（ conjugation) 轉(zhuǎn)化 (transformation) 性導(dǎo) (sexduction) 轉(zhuǎn)導(dǎo) (transduction) 一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的 DNA與另一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的DNA的交換與重組可以通過(guò)四種方式進(jìn)行： 接合 ? 接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí) ? F因子及其在雜交中的行為 ? 中斷雜交實(shí)驗(yàn)作圖 ?接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí) 1946年， amp。 的大腸桿菌雜交試驗(yàn)： ? 材料 ：大腸桿菌 (Escherichia coli)K12菌株的兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型品系： 菌株 A— 甲硫氨酸缺陷型 met 和生物素缺陷型 bio； 菌株 B— 蘇氨酸缺陷型 thr 和亮氨酸缺陷型 leu。 ? 方法 ：將 A、 B兩菌株混和，在基本培養(yǎng)基 (固體 )上涂布培養(yǎng)。 ? 結(jié)果 ：平板上長(zhǎng)出原養(yǎng)型菌落 (++++)。 上述試驗(yàn)獲得的原養(yǎng)型菌落可能產(chǎn)生于： ?親本菌株 A或 B發(fā)生了 回復(fù)突變 ； ?兩品系細(xì)胞通過(guò)培養(yǎng)基交換養(yǎng)料 — 互養(yǎng)作用 ； ?兩品系間發(fā)生了 轉(zhuǎn)化作用 ； ?發(fā)生 細(xì)胞融合 ，形成了異核體或雜合二倍體。 為了驗(yàn)證這些原養(yǎng)型菌落產(chǎn)生的可能而進(jìn)行的研究最終表明：這些解釋均不成立。 ? 結(jié)果分析 ?回復(fù)突變可能的排除 Lederbery和 Tatum利用的雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)行試驗(yàn)，已基本排除 A或 B品系發(fā)生回復(fù)突變產(chǎn)生原養(yǎng)型細(xì)菌的可能。因?yàn)椋? ? 單基因 回復(fù)突變的頻率約為 106； ? 雙基因 回復(fù)突變的頻率則為 1012，頻率很低。 ? 但試驗(yàn)中產(chǎn)生原養(yǎng)型菌落產(chǎn)生的頻率非常高（ 107），因此基本可以排除回復(fù)突變的可能。 ?互養(yǎng)作用及其排除 ? 試驗(yàn)材料 A品系 ： AB+ T1S(metbiothr+leu+T1S)； B品系 ： A+B T1R(met+bio+thrleuT1R)。 ? 試驗(yàn)方法： 將 A、 B品系混合接種在基本培養(yǎng)基表面，短時(shí)間后噴噬菌體 T1殺死 A品系，使其不能持續(xù)產(chǎn)生 thr與 leu供 B品系持續(xù)生長(zhǎng)。 ? 結(jié)果 ：仍然出現(xiàn)原養(yǎng)型菌落。 ? 結(jié)論 ：表明互養(yǎng)并非原養(yǎng)型菌落出現(xiàn)的原因，而可能發(fā)生了遺傳重組。 ?轉(zhuǎn)化作用及其排除 ?Lederbery和 Tatum曾把 品系 A的培養(yǎng)液經(jīng)加熱滅菌，加入到 B品系的培養(yǎng)物中 ，未得到原養(yǎng)型菌落，表明原養(yǎng)型菌落可能不是由轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)生。 ?戴維斯 (Dawis, 1950)的 U型管試驗(yàn) ：結(jié)果也沒(méi)有得到原養(yǎng)型細(xì)菌。 ?結(jié)論： 細(xì)胞直接接觸是原養(yǎng)型細(xì)菌產(chǎn)生的必要條件，從而否定了轉(zhuǎn)化的可能性。 ? 異核體和雜合二倍體的可能性 若細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生融合，產(chǎn)生異核體或雙雜合二倍體。這兩種情況類似于二倍體生物的雜合體 ,將產(chǎn)生原養(yǎng)型菌落。 異核體 ：指由于細(xì)胞融合而在細(xì)胞內(nèi)含有遺傳組成 不同的兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞核。 雙雜合二倍體 ：是指異核體進(jìn)一步發(fā)生核融合，形成二 倍體細(xì)胞核，核內(nèi)含有兩種遺傳物質(zhì)。 細(xì)菌為單倍配子體生物，異核體和二倍體只能暫存。培養(yǎng)繁殖過(guò)程中必將發(fā)生分離，產(chǎn)生各種缺陷型菌落，對(duì)試驗(yàn)中得到的原養(yǎng)型菌落后代研究表明，后代沒(méi)有出現(xiàn)預(yù)期的性狀分離現(xiàn)象。 ?（ 1952） 鏈霉素處理 A菌 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時(shí)間 洗滌離心 B菌 重組體未減少 基本培養(yǎng)基 鏈霉素處理 B菌 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時(shí)間 洗滌離心 A菌 無(wú)重組體產(chǎn)生 基本培養(yǎng)基 該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明細(xì)菌接合過(guò)程中 遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是單向的 ，即遺傳物質(zhì)從 A株轉(zhuǎn)移到了 B株。 ?接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí) Hayes(1952)研究表明 ： ?大腸桿菌兩種不同菌株 (品系 )接合過(guò)程中遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是 單向 的，從而認(rèn)為大腸桿菌存在兩種類型： 雌性 與雄性 ，分別作為接合過(guò)程中遺傳物質(zhì)的 受體 與 供體 。 經(jīng)過(guò)上述分析可以認(rèn)為：在 Lederbery和 Tatum及其它類似試驗(yàn)中，發(fā)生了一種不同于轉(zhuǎn)化的遺傳重組方式，稱之為 接合 。 ?接合 (conjugation)： 指通過(guò)細(xì)胞間的直接接觸將遺傳物質(zhì)從供體 (donor)轉(zhuǎn)移到受體 (receptor)的重組過(guò)程。 ? Hayes等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌在接合中作供體的能力受細(xì)胞內(nèi)一種 致育因子(性因子 )，即 F因子 控制。 ? F因子的化學(xué)本質(zhì)是 DNA分子 ，可以以 自主狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中 或 整合到細(xì)菌的染色體上。 ? F因子可在 細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)移 。 F因子與細(xì)菌結(jié)構(gòu)、生理差異 ? F因子及其在雜交中的行為 ?致育因子 ：決定細(xì)菌雄性的是 染色體外的一個(gè)共價(jià)環(huán)狀 DNA分子 ，稱為 致育因子 （ fertility factor）， 又稱為 F因子 或 F質(zhì)粒 。 ?供體菌 （雄性菌）：含有 F因子的細(xì)菌， F因子游離于宿主染色體外，記為 F+。 ?受體菌 （雌性菌）：不含有 F因子的細(xì)菌，記為 F－ 。 ?Hfr菌株 （ 高頻重組菌株）：指 F 因子整合到宿主染色體中的菌株，其重組頻率比 F+ 高 1000多倍。 F因子的存在狀態(tài) ?性傘毛形成結(jié)合橋 ， 進(jìn)而誘導(dǎo) F因子上 traYz基因表達(dá) ，產(chǎn)生核酸內(nèi)切