【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ddH2O17μl10Reaction BufferMg2+上游引物(20μmol/L)下游引物(20μmol/L)cDNA模板2μldNTPs(10mmol/L)Taq DNA聚合酶總體系25μl經(jīng)離心機(jī)混勻后各管分別加入10μl石蠟油封閉，置PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)程序如下：預(yù)變性94 oC5min變 性94 oC30 cycles30s退 火56 oC30s延 伸72 oC45s后延伸72 oC10min引物序列：RMP上游引物（P1）：5’CAG ACT CTC ATA CTC CTT GTC3’下游引物（P2）：5’GCA GCA CTG CTT TCA CTA GTG3’MPP2上游引物（P1）：5’GCT ATG GAC CTT GGG AGA A3’MPP2上游引物（P2）：5’TGG AAG CGG AAT GGA AAC3’MPP9上游引物（P1）：5’TCC CTG GAG ACC TGA GAA CC3’MPP9上游引物（P2）：5’CGG CAA GTC TTC CGA GTA GTT T3’GAPDH上游引物（P1）：5’TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA3’下游引物（P2）：5’TCC TTG GAG GCC ATG TGG GCC AT3’%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并分析電泳結(jié)果。，以4105個(gè)/每孔接種于6孔板，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞應(yīng)達(dá)到50%～70%的融合度。：實(shí)驗(yàn)分細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組（Control）、空載體組（SCR）、RMP干擾組（RMPi）、RMP過(guò)表達(dá)組（RMPo），每組設(shè)兩個(gè)副孔。轉(zhuǎn)染組加1mL轉(zhuǎn)染混合液（含3μg 質(zhì)粒和5μL Lipofectamine 2000），置37 、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)6h,每孔補(bǔ)加含20%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液1mL，繼續(xù)培養(yǎng)18h，然后更換新鮮的完全培養(yǎng)液。 按照以上脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，用實(shí)驗(yàn)細(xì)胞HL7702轉(zhuǎn)染含有GFP綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pEGFP，轉(zhuǎn)染48h后，在熒光顯微鏡下觀察，以檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。 RTPCR檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中RMP mRNA的表達(dá)水平分別收集HL7702 RMP過(guò)表達(dá)組（RMPo）轉(zhuǎn)染0h、24h、48h、72h、96h后細(xì)胞，按照以上方法操作，RTTCR法檢測(cè)HL7702細(xì)胞中不同轉(zhuǎn)染時(shí)間點(diǎn)RMP的表達(dá)。 RTPCR檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中RMP mRNA的表達(dá)水平轉(zhuǎn)染72h后，分別收集細(xì)胞對(duì)照組（Control）、空載體組（SCR）、RMP干擾組（RMPi）、RMP過(guò)表達(dá)組（RMPo）細(xì)胞，RTTCR法檢測(cè)SMMC772HepGHL7702細(xì)胞中RMP的表達(dá)。用Trizol試劑分別提取各細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量后，cDNA的合成采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。%瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶的灰度值，以RMP與GAPDH條帶的灰度比值半定量RMP mRNA的表達(dá)水平。 MTT法檢測(cè)各細(xì)胞株的生長(zhǎng)狀況 繪制生長(zhǎng)曲線將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL770HepG2細(xì)胞用完全培養(yǎng)基重懸制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度，按每孔5104個(gè)（100μL）接種于96孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，按照以上實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染，均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于轉(zhuǎn)染后0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d每孔加MTT溶液(5mg/mL) 10μL，37℃下繼續(xù)孵育4～6h后加入終止液 [10%SDS+ 1%HCl(1mol/L)]100μl/孔,于37℃充分溶解細(xì)胞內(nèi)形成的藍(lán)紫色結(jié)晶體后，計(jì)算每組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)A570平均值，以A570平均值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，觀測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)的情況。 計(jì)算促進(jìn)/抑制率按以下公式計(jì)算促進(jìn)/抑制率細(xì)胞增殖促進(jìn)/抑制率（%）=（1－實(shí)驗(yàn)組A570值/細(xì)胞對(duì)照組A570值）100%（SCR、RMPi、RMPo為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，Control對(duì)照組細(xì)胞）。 將HL7702種細(xì)胞株接種于6孔板中培養(yǎng)2h后，按照以上實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染，每組設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，并用無(wú)菌200 μl槍頭于細(xì)胞層中橫向劃線，形成寬度均勻一致的劃痕，造成培養(yǎng)細(xì)胞傷口模型，此時(shí)倒置顯微鏡下觀察拍照，測(cè)定寬度，作為劃痕后0時(shí)。具體方法為： mm標(biāo)定3個(gè)測(cè)量點(diǎn)，測(cè)量每一個(gè)點(diǎn)垂直于劃痕方向的寬度，計(jì)算3點(diǎn)的均值作為實(shí)驗(yàn)的初始劃痕寬度值。以后每隔1 d測(cè)定1次，至創(chuàng)面基本愈合。 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞粘附能力將HL7702轉(zhuǎn)染72h后的Control、SCR、RMPi和RMPo細(xì)胞分別制成細(xì)胞懸液，按1105個(gè)/mL接種至96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，分別在1h、2h、3h、4h、5h、6h和7h后棄上清液，PBS洗滌棄去尚未粘附的細(xì)胞。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度(OD)，統(tǒng)計(jì)并分析計(jì)算細(xì)胞相對(duì)粘附率 。相對(duì)粘附率(％)=(每小時(shí)各孔OD值／對(duì)照OD值) 100％。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡 染色檢測(cè)細(xì)胞周期(1) %胰蛋白酶溶液消化收集SMMC772HepGHL7702細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染72h后的Control、SCR、RMPi和RMPo細(xì)胞。(2) ，2000r/min離心5min；(3) 用1Buffer A洗滌細(xì)胞一次（2000r/min離心5min）收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1106/ml；(4) 細(xì)胞加9倍體積的70%乙醇于20 oC固定至少12h；(5) 離心收集細(xì)胞后，用1Buffer A洗細(xì)胞以除去乙醇，細(xì)胞重懸于500μl Buffer A中；(6) 加入終濃度100g/ml的RNaseA1μl，37 oC，反應(yīng)30min；(7) 加入5μl PI染液混勻，常溫閉光染色30min；(8) 激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下觀察。 Annexin V、PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡(1) %不含EDTA的胰蛋白酶溶液消化收集SMMC772HepGHL7702細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染72h后的Control、SCR、RMPi和RMPo細(xì)胞。(胰酶不能消化時(shí)間太長(zhǎng))(2) 離心管中，2000r/min離心5min；(3) 加入預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞沉淀兩次，收集1~5105個(gè)細(xì)胞；(4) 加入100μl的預(yù)冷1Binding buffer重懸細(xì)胞；(5) 加入10μl Annexin VFITC冰上混勻，避光15min。(6) 加入380μl的預(yù)冷1Binding buffer，加入10μl PI，混勻；(7) 室溫，避光反應(yīng)15min；(8) 1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm。 Western blot檢測(cè)HL7702不同轉(zhuǎn)染組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞總蛋白的提取(1) 倒掉細(xì)胞培養(yǎng)基，將細(xì)胞瓶倒扣于吸水紙上吸干殘留液體；(2) 每中方瓶細(xì)胞加3ml 4 oC預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞。重復(fù)以上操作兩次。棄凈PBS后培養(yǎng)瓶置于冰上；(3) 加入5ml預(yù)冷的PBS，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞移至10ml離心管中，2000r/min離心5min，棄凈液體；(4) 加入200μl左右含PMSF的裂解液于冰上裂解30min后，4 oC 12000r/min離心30min；(5) ，置于80oC備用。 制膠及上樣：(1) 配制12%SDSPAGE分離膠，混勻后注入邊條厚度為2mm的兩塊潔凈玻璃板間，其上加一薄層異丙醇，室溫下靜置至凝固；(2) 待分離膠完全聚合后，傾去其上的水層，以吸水紙吸凈殘余液體。插入加樣梳，緩緩加入濃縮膠，使其充滿加樣梳間的空隙，室溫下靜置，待膠完全聚合；(3) 將凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽加入電泳緩沖液，小心拔去加樣梳；4 分別取20~50181。g蛋白量的細(xì)胞總蛋白樣品及蛋白質(zhì)分子量Marker，按4：1體積比加入5SDS樣品緩沖液，配平上樣體積（總體積約15181。1）后，于沸水浴中煮5~10min使蛋白變性；(4) 將處理好的樣品按照預(yù)定的順序加入上樣孔中。(1) 接通凝膠電泳儀的電源，初始電壓60V；(2) 溴酚藍(lán)染料的前緣進(jìn)入分離膠上緣后提高電壓至160V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)泳出分離膠的下緣。(1) 從玻璃板中小心取出凝膠，將其浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中；(2) 取與膠同樣大小的硝酸纖維素膜，以95%乙醇浸泡5s后浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液5min以上待用；(3) 按順序在轉(zhuǎn)移夾內(nèi)放置預(yù)先經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡的海綿、三層濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠、三層濾紙、海綿，趕走每層之間的氣泡；(4) 將轉(zhuǎn)移夾放入轉(zhuǎn)移槽，膜在正極、膠在負(fù)極，轉(zhuǎn)移槽浸入冰水混合物中，90V穩(wěn)壓轉(zhuǎn)移3h左右；(5) 把硝酸纖維素膜浸入5%脫脂奶粉，室溫?fù)u動(dòng)2h。(1) 以TBST洗膜，10min 3次；(2) 第一抗體封閉：以TBST 1：200稀釋，去除所有氣泡，4℃振搖過(guò)夜；(3) 以TBST洗膜，10min 3次；(4) 第二抗體封閉：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1：4000），去除所有氣泡，室溫下振搖60min；(5) 以TBST洗膜，10min 3次。(1) ，按1：1的比例混合，在暗室中與硝酸纖維素膜搖動(dòng)孵育1min；(2) 用濾紙沾干膜上的液體，用保鮮膜包好，用感光膠片在壓片盒中曝光約1min；(3) 曝光后的感光膠片在顯影液中顯影約30s，定影液中定影1min，用水沖洗后晾干；(4) 根據(jù)曝光情況調(diào)整曝光時(shí)間，壓片、顯影及定影，選擇滿意的膠片。 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法緊系分析處理數(shù)據(jù)，P。2 結(jié)果 RTPCR檢測(cè)內(nèi)源性RMP mRNA在不同細(xì)胞系中的表達(dá)為了分析RMP與腫瘤尤其是肝癌的關(guān)系，我們選擇了三種正常肝細(xì)胞系和兩種肝癌細(xì)胞系，以及人胚肺成纖維細(xì)胞和胃癌、宮頸癌細(xì)胞，采用RTPCR法檢測(cè)內(nèi)源性RMP在不同細(xì)胞系中的表達(dá)情況。產(chǎn)物經(jīng)電泳后結(jié)果顯示（圖11a）：各組目的條帶均有顯示，但是條帶亮度強(qiáng)弱不同。利用Bandscan軟件分析條帶灰度值，計(jì)算各組細(xì)胞RMP/GAPDH灰度比值，結(jié)果（圖11b）：RMP在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)水平普遍高于正常細(xì)胞株（P）。由于RMP首先是在肝癌細(xì)胞株篩查得到的，后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要選擇正常肝細(xì)胞HL7702和肝癌細(xì)胞SMMC772HepG2作為研究對(duì)象。圖11a RTPCR檢測(cè)內(nèi)源性RMPmRNA在各細(xì)胞系中的表達(dá)圖11b RMPmRNA在各細(xì)胞系中的表達(dá)結(jié)果分析 HL7702細(xì)胞中RMP mRNA的表達(dá)HL7702轉(zhuǎn)染含有GFP綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pEGFP，轉(zhuǎn)染48h后，在熒光顯微鏡下觀察，以檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率（圖12）。結(jié)果顯示，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，形態(tài)完整，細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)70%左右。由于本實(shí)驗(yàn)主要采用的是HL7702細(xì)胞株，由以上結(jié)果可知，內(nèi)源性RMP在HL7702中的表達(dá)很低，故為了檢測(cè)RMP在不同轉(zhuǎn)染時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，我們選擇過(guò)表達(dá)組來(lái)確定轉(zhuǎn)染時(shí)間點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加RMP表達(dá)逐漸升高，在轉(zhuǎn)染RMPo后72h RMP表達(dá)達(dá)到最高（13），之后，RMP表達(dá)逐漸降低。由此，為本實(shí)驗(yàn)方法的可行性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。圖12 Lipofectamine 2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)a：普通光鏡 b：熒光顯微鏡圖13 HL7702細(xì)胞中RMPmRNA在不同轉(zhuǎn)染時(shí)間點(diǎn)的表達(dá) 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的鑒定三種細(xì)胞株SMMC772HepG2和HL7702分別轉(zhuǎn)染RMP空載體、RMP干擾和RMP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)染72h后，收集細(xì)胞對(duì)照組（Control）、空載體組（SCR）、RMP干擾組（RMPi）、RMP過(guò)表達(dá)組（RMPo）細(xì)胞，RTTCR法檢測(cè)SMMC772HepGHL7702細(xì)胞中RMP的表達(dá)。電泳結(jié)果顯示：在HL7702細(xì)胞中內(nèi)源性RMP表達(dá)水平很低，RMPi組與Control和SCR相比無(wú)明顯差別（P），而RMPo組中RMP表達(dá)顯著增高（P）（圖14 a）；在肝癌細(xì)胞株SMMC7721和HepG2細(xì)胞中，RMPi組與Control和SCR相比RMP表達(dá)明顯降低，RMPo組中的表達(dá)明顯升高（P）（圖14 b c）。圖14 RMPmRNA在不同細(xì)胞株中不同轉(zhuǎn)染組中的表達(dá) RMP對(duì)肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞增殖作用的影響MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染第一天至第六天的細(xì)胞生長(zhǎng)活力，并繪制細(xì)胞增殖曲線（圖15 a b）。由圖可見(jiàn)：在HL7702細(xì)胞中，由于該細(xì)胞株內(nèi)源性RMP表達(dá)水平很低，干擾前后RMP表達(dá)無(wú)顯著性差異（14 a），MTT檢測(cè)結(jié)果顯示RMPi組與細(xì)胞組7702和SCR組相比細(xì)胞增殖沒(méi)有顯著差異（P）；而RMPo組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快（P）,表明RMP基因過(guò)表達(dá)具有明顯促進(jìn)人正常肝細(xì)胞增殖的作用；在HepG2細(xì)胞中，RMPi組細(xì)胞增殖明顯受到抑制（P），而RMPo組細(xì)胞與7702細(xì)胞組和SCR相比增值明顯加快（P）。在兩種細(xì)胞中，Vector和SCR組與7702細(xì)胞組相比細(xì)胞生長(zhǎng)均無(wú)明顯差異（P）。圖15a RMP對(duì)HL7702細(xì)胞增殖曲線圖15b RMP對(duì)HepG2細(xì)胞增殖曲線 RMP對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 采用體外劃痕實(shí)驗(yàn)法比較各組細(xì)胞的遷移能力（圖16a b），RMPi組、SCR組和7702細(xì)胞組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，劃痕寬度逐漸變窄，劃痕由于細(xì)胞的遷移生長(zhǎng)逐漸融合入，三組細(xì)胞的遷移能力比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P）。與此相比，RMPo組細(xì)胞的遷移能力顯著提高（P）。結(jié)果表明在正常肝細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RMP可提高細(xì)胞的遷移能力?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteina