【正文】 率較高，每分鐘可操作100個左右的細胞，比顯微注射法效率提高20倍，比化學(xué)法提高三個數(shù)量級； 另外，還可進行細胞器的基因轉(zhuǎn)化，由于激光微束小于細胞器，它可以在顯微水平上直接對細胞器擊孔，實現(xiàn)外源DNA對細胞器的轉(zhuǎn)移． 但其需要昂貴的儀器設(shè)備，轉(zhuǎn)化頻率只有102～104。所以，轉(zhuǎn)座子作為一種新的轉(zhuǎn)移外源基因的載體系統(tǒng)和方法，還需要有更多的實驗來證實和完善。 RFLP檢測法二、 如季慧強等(1993)以玉米DNA導(dǎo)入二棱大麥，在D1的16株中有2株變異，％，還有8株是潛在變異株，在D2才出現(xiàn)變異，這部分的變異占總處理數(shù)的50％，因此總變異率是62．5％。 第四個特點是變異的意外性。 莖蘗的生長習(xí)性主要是指直立生長與匍匐生長兩類。 當(dāng)以早熟品種為受體時，出現(xiàn)超早熟類型的變異較少，而出現(xiàn)稍遲的類型較多。（2）堊白度是堊白粒率與堊白面積的乘積，是稻米外觀品質(zhì)的極其重要的指標(biāo)。在這種情況下，選擇是困難的，但它卻為育種提供了新的種質(zhì)，因而也是有價值的． 四、形態(tài)變異與生理變異 形態(tài)變異是直觀的，容易辨別，而生理變異則要通過生理生化分析才能能知道。異地鑒定：在當(dāng)?shù)貤l件不能滿足性狀鑒定需要時，可在適宜的異地 進行鑒定。 二是在導(dǎo)入的材料較多時，則可按組合分單株(單穗、單鈴)種植，因為有時在Dl代即表現(xiàn)變異，可以提早進行選擇．按單株收獲?？疾斓捻椖浚? 一是生育期。（5）品種審定及推廣。 兩者均對水稻產(chǎn)量性狀的遺傳控制起著重要的作用。(3)鑒定各高產(chǎn)品種所具有的有利QTL及其連鎖的分子標(biāo)記。 (2)QTL研究結(jié)果顯示,互作基因的共同作用對水稻產(chǎn)量的遺傳控制也起著重要的作用,部分QTL的表達可能在一定程度上受到遺傳背景的制約。形態(tài)檢測：是最先采用的體細胞無性系變異檢測方法。 ②選擇聚集了雙親絕大多數(shù)的有利等位基因的純系。其理論根據(jù)是：控制水稻產(chǎn)量性狀的基因廣泛地分布于水稻基因組的各個區(qū)域,而不同水稻材料在不同基因座位上表現(xiàn)出有利的效應(yīng)。 在同一座位上,不同等位基因之間的互作也可能不同。 五是生長情況。 如果仍保持受體的特征特性，則應(yīng)淘汰， （2）怎樣進行田間選擇? 全部育種材料都必須經(jīng)過田間種植，根據(jù)多代種植的表現(xiàn)，來確定其優(yōu)劣，然后汰劣選優(yōu)。 需要注意的是：有的材料分離世代也很長，有的甚至達6—7代才穩(wěn)定。在經(jīng)常發(fā)生的逆境條件下進行鑒定。但在外源DNA轉(zhuǎn)化后代中，有時形態(tài)特征沒有變異，但某項生理特性卻產(chǎn)生變異。結(jié)果： （1）各項品質(zhì)性狀的變異系數(shù)大小依次為堊白度直鏈淀粉含量膠稠度米膠長糊化溫度級別蛋白質(zhì)含量整精米率精米寬精米長精米率糙米率。 表現(xiàn)出變異的多樣性。 四類是特殊優(yōu)良的葉形變異。 第二個特點是變異的廣泛性。四是其他原因。因此，植物轉(zhuǎn)基因工程的策略要轉(zhuǎn)向利用全植物源的基因，在不進行抗生素篩選的前提下對導(dǎo)入進行PCR 、 Southern 檢測。 三、電泳轉(zhuǎn)化法 電泳轉(zhuǎn)化法的基本原理是借在一定電場強度下由負(fù)極向正極泳動的DNA泳動力，將DNA引入到靠正極端的受體組織細胞中． 細胞壁是以纖維絲為基質(zhì)而組成的，含有許多小孔，在電場中DNA遷移可通過細胞壁的小孔，并可通過質(zhì)膜而進入細胞． 四、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)法 轉(zhuǎn)座子：是指在細胞中能從同一條染色體的一個位點轉(zhuǎn)移到另一個位點或從一條染色體上轉(zhuǎn)移到另一條染色體上的一段特殊的DNA序列； 它通常包含著二種因子：一是自主因子，具有使自身剪切或轉(zhuǎn)座的能力；另一是非自主因子，只有在同一組自主因子存在時才能剪切或轉(zhuǎn)座。一、基本原理激光是一種很強的相干單色電磁射線，細胞膜系統(tǒng)或細胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)由于能夠吸收特定波長的激光產(chǎn)生熱效應(yīng)而引起某種程度的損傷。隨著E的不斷增大，V也不斷升高，于是膜被壓縮變薄。 且此方法不受植物種屬的限制，在具備有性生殖過程的任何植物上都能應(yīng)用． 另外，此法簡便，易于掌握，可以在大田，盆栽或溫室中進行，育種時間短，篩選遺傳穩(wěn)定的品系一般只需3—4代時間， 再者，通過外源總DNA片段的導(dǎo)入可以了解一些具有重大經(jīng)濟價值的農(nóng)藝性狀是否能夠通過DNA片段進行轉(zhuǎn)移、這些性狀是單基因性狀還是多基因性狀，從而能為目的基因的克隆提供參考和材料。第四節(jié) 浸漬法 浸漬法：是指將植物的種子，胚、胚珠，子房、花粉粒、幼穗，懸浮細胞甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用滲透作用把外源基因?qū)胧荏w細胞并得到整合與表達的一種轉(zhuǎn)化方法。 載體介導(dǎo)法（間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)）:是將目的DNA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌或病毒中，并以之為載體，隨著它們對植物的感染面將目的DNA導(dǎo)入植物細胞中。進行紫外吸收光譜法檢測核酸要獲較準(zhǔn)確的濃度：一要避免核酸分子的相互污染。不管采用哪種方法，應(yīng)該考慮到以下幾點：第一，如果需鑒定的材料數(shù)量有限，就應(yīng)采取DNA微量提取方案；第二，如果材料含有較多的類萜、丹寧、多糖等，就應(yīng)在DNA提取中考慮是否能控制住這些物質(zhì)對限制性內(nèi)切酶或PCR聚合酶的抑制作用；第三，如果采用PCR分析，DNA提取步驟越少越好，這是因為PCR反應(yīng)極其靈敏，多步驟及多種試劑容易引起交叉污染，從而影響PCR分析的準(zhǔn)確性。每667m2產(chǎn)量可達325kg，比供體提高30%．此品系集天然色素，高蛋白、高產(chǎn)于一體，為黑色保健食品工業(yè)的發(fā)展提供了新原料。這項研究有三個國內(nèi)外首創(chuàng)：一是將海水植物紅樹的總基因?qū)氲参铮欢侵苯佑煤Ｋ疂补?；三是高耐鹽性。（2）小麥 于元杰等 應(yīng)用浸滴法將小麥供體京花l號DNA導(dǎo)入受體814527品系，通過系譜法育成D259品系．該小麥品系分蔡性強、長勢旺、抗逆性強，對肥反應(yīng)敏感；高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病，抗干旱，在未澆水的早地試種，表現(xiàn)良好．（3）棉花 吳小月應(yīng)用授粉后外源DNA導(dǎo)入技術(shù)將中棉常熱黑子的DNA導(dǎo)入受體陸地棉品種岱紅岱，成功地育成了一個高產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)，吐絮集中、抗逆性強、耐潰澇并耐枯萎病的棉花新品種——湘棉12號，1989年已通過湖南省晶種審定。經(jīng)過培育與選擇從不同組合中分別選出了既豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)，又抗病的品系。這期間，一共召開了3次植物分子育種學(xué)術(shù)討論會，分子學(xué)、分子遺傳學(xué)和作物育種學(xué)的專家們匯聚一堂，總結(jié)交流經(jīng)驗、切磋技藝、共商發(fā)展，使植物分子育種事業(yè)進入了新階段，總的來說，植物分子育種第一層次的技術(shù)，即帶目的性狀的外源DNA導(dǎo)入技術(shù)，目前已為廣大育種家們所接受，它克服了常規(guī)育種的局限性，打破了物種隔離的障礙，縮短了育種時間，為生產(chǎn)提供了一批優(yōu)良品種。 要點：（1）認(rèn)為就整體分子而言，遠緣親本間的染色體結(jié)構(gòu)是不親和的，容易相互排斥；（2）根據(jù)進化的觀點，局部DNA分子部分基因間的結(jié)構(gòu)有可能保持一定的親和性；因而遠緣DNA片段有可能進入受體細胞，并在母本DNA復(fù)制過程中，這種DNA片段便與受體基因組相應(yīng)區(qū)段整合。植物分子育種第一章 植物分子育種技術(shù)概論常規(guī)育種雖然在農(nóng)作物產(chǎn)量提高和品質(zhì)改良方面取得了很大成績，但它存在著局限性：一是遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移難以突破生物學(xué)隔離的障礙，使優(yōu)良種質(zhì)資源的利用受到限制。周光宇提出了“DNA片段雜交”假說，并應(yīng)用同工酶和分子雜交等技術(shù)對祖德明等培育的高梁稻及其親本材料進行了分析，使這一假說得到了分子驗證。第五節(jié) 植物分子育種與作物遺傳改良育種實踐證明，育種上要有新突破，目前必須抓住兩項工作：①廣泛搜集有益的種質(zhì)資源，并加以利用。 例如D041新種質(zhì)系，以小麥841527為母體，導(dǎo)入牛胸腺DNA，從其變異后代中經(jīng)系譜法選育而成．D041不僅早熟，而且高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)，同時高抗條銹病和干熱風(fēng)。 于元杰等 在棉花分子育種研究中將羅布麻DNA導(dǎo)入魯棉6號，育成抗蟲，抗鹽種質(zhì)系91015．經(jīng)中國農(nóng)科院棉花研究所鑒定，在其他供試棉花品種的棉鈴蟲蟲株率高達100％的情況下，該種質(zhì)系的蟲株率僅為26，7％，表現(xiàn)了良好的抗蟲性．該系對鹽堿的抗性也較強，％的條件下能正常出苗． 1993年在山東無棣縣鹽堿地(％)試種，％，從同一組合所獲得的另一棉花種質(zhì)系91010，表現(xiàn)抗鹽、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等特點，91010在抗鹽性盆栽鑒定中，%的條件下，出苗正常；用0，6％NaCl溶液授種發(fā)芽檢測，在其他棉花品種不能正常發(fā)芽的情況下，％。 、改良品質(zhì) 在育種中值得注意的是在綜合性狀優(yōu)良的基礎(chǔ)上，將高產(chǎn)與優(yōu)質(zhì)結(jié)合起采，自然還要考慮抗性和適應(yīng)能力，這是選育新品種的總趨勢。 萬文舉等 應(yīng)用浸胚法將慈利玉米DNA導(dǎo)入水稻品種湘早秈8號，獲得了大量變異后代，從中選出高產(chǎn)、抗病抗逆性強的新品系GER1。第一節(jié) 植物總DNA提取方法一、植物總DNA大量提取方法 二、植物總DNA微量提取方法三、植物總DNA稍大量提取方法含多酚類材料的DNA提取方法以棉花為例；，加5ml預(yù)冷95%乙醇于研缽中勻漿。例如DNA中混有RNA或寡核苷酸或者RNA存在有DNA，二要對核酸樣品進行適當(dāng)?shù)南♂尅? 直接導(dǎo)入法（直接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)）:是以裸露的外源DNA通過化學(xué)或物理方法直接導(dǎo)入植物細胞，它主要包括前面所說的化學(xué)方法和物理方法。這種方法實際上在經(jīng)典的基因工程誕生之前就有人開始探索了，這一想法的萌芽是受細菌轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的啟發(fā)，早在1969年，德國學(xué)者Hess便報道了用外源DNA浸泡矮牽牛的萌動種子而出現(xiàn)變異性狀的結(jié)果。 但此法的使用在時間上受到開花季節(jié)的限制，而且應(yīng)用總DNA片段的導(dǎo)入，篩選到的子代可能帶有目的基因以外的DNA片段． 總之，目前花粉管導(dǎo)入法已有了一定的理論基礎(chǔ)和大量的實踐證實，它的簡捷特性以及可以直接得到轉(zhuǎn)化種子等優(yōu)點使之成為目前廣泛使用的轉(zhuǎn)化方法之一．第六節(jié) 顯微注射法顯微注射： 是利用顯微裝置將大分子物質(zhì)或細胞器注射到培養(yǎng)細胞的一項技術(shù)。 當(dāng)V升高到一定值時，膜被擊穿形成微孔，此壓稱之為擊穿電壓(Vc)． 如果電場強度不再繼續(xù)增大，此時所形成的膜孔數(shù)量少、孔徑小，間隔一段時間后即可復(fù)原，這稱之為“可逆擊穿”?！? 將植物這種內(nèi)源轉(zhuǎn)座子從系統(tǒng)分離出來，構(gòu)建在含有目的基因的表達載體上，并通過適當(dāng)方法將之導(dǎo)入到受體細胞中，利用轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座功能，可將其鄰近的目的基因轉(zhuǎn)移到受體細胞的染色體上，即可實現(xiàn)外源基因的有效整合與表達 。 一、PCR分析 二、Southern雜交第二節(jié) 針對非確定DNA的分子檢測 以基因組總DNA著做遺傳轉(zhuǎn)化是當(dāng)前分子育種常采用的轉(zhuǎn)化方式。如某些藥劑的使用等。 根據(jù)許多研究者和我們的實踐表明，導(dǎo)入后代各個性狀都可能產(chǎn)生變異，從形態(tài)特征包括根，莖，葉、種子(果實)的形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)，到生理特性包括光合特性，抗病性、抗逆性，以及品質(zhì)性狀如蛋白質(zhì)含量、纖維長度等，因此我們稱之為廣泛變異。 如葉片較硬且直立的類型 (4)莖蘗生長的變異 莖蘗生長的變異包括莖蘗生長狀況與生長習(xí)性兩方面內(nèi)容． 莖蘗生長狀況主要是指莖蘗著生的集散程度。 （2）出現(xiàn)一些特殊個體 棉花外源DNA通常都是采用注射法導(dǎo)入，D2代的變異范圍廣，往往出現(xiàn)一些特殊個體，植株高大，生長優(yōu)勢很強，形態(tài)比較特殊，為選育新品種提供了豐富的材料。 變異系數(shù)在20％以上的有5個性狀，其中堊白度達37．78％。至于多個性狀變異前文巳敘述了很多例證，多個性狀的變異既可同時在一個單株上出現(xiàn)，也可以在一個群體內(nèi)同時出現(xiàn)。誘發(fā)鑒定：如抗性。 當(dāng)然其原因是多方面的，可能是由于被整合的外源DNA片段需要經(jīng)過多代調(diào)整，使其內(nèi)部結(jié)構(gòu)趨于合理，也可能是由于其他的原因，如天然異交等。 育種的方向，也是通過選擇來實現(xiàn)的。 如整個生長期是否清秀，是否有病蟲害發(fā)生，嚴(yán)重程度，成熟期落色好還是差，當(dāng)發(fā)生某些災(zāi)害性天氣后，植株是否受害及嚴(yán)重程度，如開花期正遇上連續(xù)陰雨天，開花結(jié)實是否正常，雙季晚稻在寒露風(fēng)之后，葉片是否受害，空秕粒的多少及籽粒充實度等；早稻秧苗期遇低溫陰雨，秧苗生長雖否正常等。 水稻QTL的等位基因互作方式: 以加性作用和顯性作用為主,超顯性作用為輔。部分產(chǎn)量QTL具有較大的加性效應(yīng),而且能在不同的遺傳背景和環(huán)境條件下得到表達。由育種家進行產(chǎn)量試驗,鑒定其作為常規(guī)品種的利用價值。利用形態(tài)觀察很難立即區(qū)分變異是否為遺傳變異或外遺傳變異。 (1)途徑一只能累積加性效應(yīng)； 途徑二既可累積加性效應(yīng),又可同時累積加性效應(yīng)和超顯性效應(yīng)。(2)以低產(chǎn)水稻品種為共同親本,分別與一系列高產(chǎn)水稻品種雜交。 另一類的表達則有賴于互作因子的共同作用。（4）品系鑒定、品比試驗及區(qū)域試驗 經(jīng)過D3或D4代的選育，獲得優(yōu)良穩(wěn)定的系統(tǒng)，進入更高一級的試驗。 田間選擇，主要由感官鑒定來完成。 種植的方法有兩種： 一是將所獲得的種子按組合混合種植，其好處是簡單；收獲時按組合混收。當(dāng)?shù)罔b定：在當(dāng)?shù)貤l件能滿足性狀鑒定需要時，可在當(dāng)?shù)剡M行鑒定。如果目的性狀與其他性狀連鎖，出現(xiàn)的可能性更大。變異是顯著的。 （4）生育期 外源DNA導(dǎo)入水稻的后代，生育期的變異一般不超過供體與受體的生育期范圍，多數(shù)傾向于受體，即與受體生育期大致接近。 外源DNA導(dǎo)入后代，與有性雜交后代的變異情況相差不大，散，中，緊三種類型都可能出現(xiàn)，主要與受體和供體自身的特點有關(guān)。 如特殊的色素，以野生物種作供體，通常帶有野生性狀，如野生稻的宿根性，葉片耐衰老性等?？傊陻?shù)X100％。一、再者，通過轉(zhuǎn)座子所導(dǎo)入的外源基因的遺傳穩(wěn)定性還有待進一步研究。二、基本特點 激光徽束轉(zhuǎn)化技術(shù)同基因槍、電擊穿孔和超聲波法一樣，屬于物理轉(zhuǎn)化方法。 它除了同樣具有PEG法的優(yōu)點外，還具有操作簡便、轉(zhuǎn)化效率較高的特點，特別適用于瞬時表達的研究。 近年來，植物懸浮細胞、花粉粒以及多細胞結(jié)構(gòu)的分生組織、胚狀體等都被用作顯徽注射的受體材料，并使該方法在理論上和技術(shù)上都有了進一步的發(fā)展 ?，F(xiàn)已證明植物細胞至少可