【正文】 次級(jí)卵母細(xì)胞經(jīng)過一系列的生長(zhǎng)發(fā)育最終形成有受精能力的成熟卵母細(xì)胞的過程。而即使是從同一品種和統(tǒng)一地區(qū)的豬種所獲得的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，其培養(yǎng)效果也會(huì)因豬的健康情況和卵巢質(zhì)量等的影響而有很大的不同，比如，處在育齡盛期的健康母豬，其卵巢的體積大，表面卵泡多而且直徑在36mm 的卵泡相對(duì)比例就會(huì)較高，抽得的卵母細(xì)胞形態(tài)完好，裸卵少，相對(duì)體外成熟培養(yǎng)效果也好。根據(jù)卵母細(xì)胞外面包裹的卵丘細(xì)胞的層數(shù)將其分成三級(jí)。目前，常用的豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)方式有微滴培養(yǎng)法、套皿培養(yǎng)法及普通的單皿培養(yǎng)法。在早期的研究中，促性腺激素多數(shù)存在于整個(gè)體外培養(yǎng)過程，但1994 年，F(xiàn)unashi 等的研究表明，在豬卵母細(xì)胞IVM 時(shí)，培養(yǎng)前20 h 加入PMSG、hCG、E2，而在培養(yǎng)后20 h 去除，可增加卵母細(xì)胞的成熟率，同時(shí)可以促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和胞質(zhì)的成熟，而且有利于卵母細(xì)胞的發(fā)育和受精。TGFα，在結(jié)構(gòu)上和功能上與EGF 相似，因而也可以與EGF受體結(jié)合，誘導(dǎo)豬卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散，促進(jìn)卵母細(xì)胞核成熟。裸卵僅能夠利用周圍介質(zhì)中的丙酮酸和三羧循環(huán)的中間產(chǎn)物，不能直接利用葡萄糖卵丘細(xì)胞可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，為卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育提供能量。m）；級(jí)成熟卵為“卵丘細(xì)胞輕度擴(kuò)展”，卵丘細(xì)胞仍緊緊地粘貼在透明帶上。結(jié)果證實(shí)裸卵成熟培養(yǎng)后CG完全消失或卵子本身形態(tài)出現(xiàn)異常。研究表明，卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)與受精率和囊胚發(fā)育率有強(qiáng)相關(guān)性。液滴預(yù)先在二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡2h以上。這些天尋找資料，思考設(shè)計(jì)方案，穿梭于東西校區(qū)之間，不僅鍛煉了身體，也鍛煉了我們的心智，每個(gè)人都很認(rèn)真的學(xué)習(xí)、準(zhǔn)備，老師的嚴(yán)格要求是對(duì)我們最好的磨練與監(jiān)督。不同類型COCs的孤雌胚胎發(fā)育能力卻不同，這可能是包裹卵丘細(xì)胞較少的卵母細(xì)胞在體外成熟后已有老化的趨勢(shì)，卵裂后發(fā)育至囊胚的能力下降，但包裹3層以上卵丘細(xì)胞及附帶FSP的COCs在體外成熟后孤雌激活時(shí)正處于發(fā)育的較佳時(shí)期，能夠很好的發(fā)育至囊胚期。B級(jí)：卵丘細(xì)胞為1～2層；或卵丘細(xì)胞雖在3層或3層以上，但是不完整，部分為1～2層。(3) 去除卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞在體外成熟過程中，皮質(zhì)顆?？赡艽嬖诶^發(fā)性生成障礙或者數(shù)量異常，該結(jié)果可能是去除卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞存在體外受精障礙的原因之一。卵丘細(xì)胞的形態(tài)不依賴于供體的類型，擁有完整多層并且擴(kuò)散的卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞的比例最大（％～46％），其次是帶有致密多層的卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞（％～28％），裸卵的比例小于7％。卵母細(xì)胞也可能通過分泌特殊因子或通過促卵泡素（FSH）和EGF刺激卵丘透明質(zhì)酸酶的合成，調(diào)節(jié)卵丘擴(kuò)散，從而解除卵丘卵母細(xì)胞的異源連接，促使減數(shù)分裂恢復(fù)。壁層顆粒細(xì)胞與卵丘細(xì)胞之間，卵丘細(xì)胞與卵丘細(xì)胞之間以及卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間，存在著廣泛的縫隙連接。Vatzias 等研究發(fā)現(xiàn)冷凍卵泡液在促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟、降低多精受精方面優(yōu)于新鮮卵泡液，孟慶剛等認(rèn)為在激素存在的條件下，pFF 具有促進(jìn)豬小腔卵泡卵母細(xì)胞體外成熟的作用。在卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系中，F(xiàn)SH、LH 有利于改變卵丘細(xì)胞的代謝機(jī)能，并阻斷卵丘細(xì)胞通過胞間連接向卵母細(xì)胞分泌減數(shù)分裂抑制因子的途徑，從而使卵母細(xì)胞恢復(fù)成熟分裂過程 。多數(shù)培養(yǎng)基在配制前都已將pH 值調(diào)好，并具有一定的緩沖能力，因此，5%CO2 則剛好是維持pH 所必需。韓毅冰等也證明小直徑卵泡卵母細(xì)胞(1~2 mm)成熟率不如大直徑卵泡卵母細(xì)胞（2~6mm）。在卵母細(xì)胞的成熟過程中，有很多化學(xué)物質(zhì)及因子參與反應(yīng)，因此，只有當(dāng)體外成熟條件與體內(nèi)卵母細(xì)胞發(fā)育所需要的環(huán)境非常接近時(shí)，才能獲得較高的成熟率，從而為進(jìn)一步的科研工作提供優(yōu)質(zhì)大量成熟的卵母細(xì)胞。通過本次設(shè)計(jì)，擬定探討卵丘細(xì)胞的存在和不同形態(tài)對(duì)豬卵母細(xì)胞的成熟率的影響。卵母細(xì)胞的體外成熟包括細(xì)胞核的成熟、細(xì)胞質(zhì)的成熟、卵丘細(xì)胞的成熟、透明帶的成熟以及其卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的發(fā)育成熟等一系列復(fù)雜的變化過程，主要表現(xiàn)在細(xì)胞核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟兩個(gè)方面。反之，取自仔豬、處女豬、老母豬及老弱病殘豬的卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)效果則較差。A 級(jí)：卵丘細(xì)胞在3 層或3層以上。相對(duì)于普通的單皿培養(yǎng)法而言，微滴培養(yǎng)法和套皿培養(yǎng)法可以更好的保持細(xì)胞發(fā)育所需要的微環(huán)境，同時(shí)減少微生物的污染。蔡令波等在培養(yǎng)后期去除促性腺激素也得出了相似結(jié)果。NGF 也是豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，能影響豬卵母細(xì)胞成熟的動(dòng)力學(xué)，加快進(jìn)入M11 期。如果兩者間縫隙連接過早破壞，卵母細(xì)胞可能停止發(fā)育［2］。一般絕大多數(shù)的1級(jí)成熟卵和多數(shù)的2,級(jí)成熟卵均已達(dá)到成熟狀態(tài)，排出第一極體.卵丘擴(kuò)展與卵母細(xì)胞成熟之間的關(guān)系很復(fù)雜。可見，裸卵是一類尚未成熟即趨于退化的卵子，不能正常受精及進(jìn)一步發(fā)育。所以，繼續(xù)深入認(rèn)識(shí)卵母細(xì)胞的成熟規(guī)律、改善體外成熟培養(yǎng)環(huán)境、建立一種完善的卵母細(xì)胞體外成熟系統(tǒng)是當(dāng)前胚胎工程研究的重要內(nèi)容之一。成熟培養(yǎng)條件39℃ ,5%的CO2與飽和濕度，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24 h。在課程設(shè)計(jì)的過程中，過的充實(shí)而又緊張：查閱資料、文獻(xiàn)，確定自己的設(shè)計(jì)方案，查閱相關(guān)資料和課程設(shè)計(jì)報(bào)告的撰寫。劉酷等根據(jù)卵母細(xì)胞周圍卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)綿羊進(jìn)行分類成熟培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)卵丘細(xì)胞包裹3層以上和包裹13層疏松卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞成熟率分別為82．4％和80．6％，其試驗(yàn)結(jié)果與本試驗(yàn)卵母細(xì)胞體外成熟結(jié)果基本一致，這在一定程度上說明卵丘細(xì)胞層包裹程度對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟后體外成熟率并沒有顯著的影響。 豬卵母細(xì)胞的分級(jí)收集的未成熟豬卵母細(xì)胞以卵丘細(xì)胞層數(shù)為準(zhǔn)分為三級(jí)：A級(jí)：卵丘細(xì)胞在3層或3層以上。(2) 去除卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞在體外成熟過程中線粒體由簇狀分布逐漸變?yōu)樯⒉加诼奄|(zhì)內(nèi)，該過程與卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體成熟過程中線粒體變化規(guī)律相符。目前的研究中，回收的大部分卵母細(xì)胞都有完整的卵丘細(xì)胞包圍（致密或分散）。 卵丘擴(kuò)展對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響在卵母細(xì)胞成熟過程中，卵丘細(xì)胞也隨之成熟而充分?jǐn)U展，從而中斷了卵丘細(xì)胞之間以及卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的緊密連接狀態(tài)，進(jìn)而疏通了這些細(xì)胞之間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換的通道。到有腔卵泡時(shí)，卵泡細(xì)胞分為兩部分：一部分為壁層顆粒細(xì)胞，與基膜相連：另一部分為包圍卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞。Yashida 等報(bào)道在成熟培養(yǎng)基中添加豬卵泡液可顯著提高豬卵母細(xì)胞的核成熟率、正常受精率及卵裂率。但葉華虎等研究發(fā)現(xiàn)，受精后胚胎發(fā)育能力NCSU23占明顯優(yōu)勢(shì)。在這兩種氣相中，CO2 的含量很關(guān)鍵。Yoon等研究發(fā)現(xiàn)來自3~8mm直徑卵泡的卵母細(xì)胞成熟率顯著高于小于3mm的卵泡卵母細(xì)胞(91%vs 58%)。透明帶是一層糖蛋白膜，受精時(shí)可以結(jié)合并誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)，并阻止多精受精。第一部分設(shè)計(jì)擬定探索出卵丘細(xì)胞的存在能夠提高卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟；第二部分設(shè)計(jì)是在第一部分的基礎(chǔ)上分析卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)母細(xì)胞成熟的影響。在形態(tài)學(xué)方面表現(xiàn)為紡錘體形成，核仁致密化，染色質(zhì)高度濃縮成染色體，第一極體釋放，細(xì)胞器重組，卵丘細(xì)胞擴(kuò)展、膨脹和透明帶軟化等一系列生理變化[vii]。所采集的卵巢所處的性周期同樣影響卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)結(jié)果，根據(jù)采集卵巢所處的性周期，將其分為卵泡期和黃體期，再將黃體期卵巢分為有黃體期卵巢和無黃體期卵巢。B 級(jí)：卵丘細(xì)胞為1~2 層；或卵丘細(xì)胞雖在3 層或3 層以上，但是不