【正文】 的測(cè)定 13 結(jié)果 1 乳酸菌的分離 1 基因組DNA的提取 1 16S rRNA的PCR擴(kuò)增片斷電泳結(jié)果分析 1 重組子的篩選和鑒定 1 16S rRNA分析 1 鏈霉素抗性分析結(jié)果 14 結(jié)論 1總結(jié)與體會(huì) 1致謝詞 1參考文獻(xiàn) 1摘 要以市售的有機(jī)白蘿卜為研究對(duì)象，分析其表皮附生的乳酸菌對(duì)鏈霉素的抗藥性。目前已知天然抗生素不下萬(wàn)種。是繼青霉素后第二個(gè)生產(chǎn)并用于臨床的抗生素。第二種是在質(zhì)粒載體上將PCR 產(chǎn)物克隆，然后進(jìn)行測(cè)序。配制液體MRS培養(yǎng)基200mL，滅菌后倒10個(gè)平板，待其冷卻凝固后于恒溫箱過(guò)夜，用移液槍取100μl菌種于平板，用玻璃涂棒將菌種涂均勻，作好標(biāo)記，每個(gè)濃度的細(xì)菌液接兩個(gè)平板，于37℃恒溫箱培養(yǎng)48h[6]。 重組質(zhì)粒的提取和鑒定質(zhì)粒的提取參見(jiàn)質(zhì)粒小提試劑盒（Omega公司）的說(shuō)明操作，步驟如下：(1) 柱平衡步驟：向吸收柱CB3中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl的平衡液BL，12000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 最小抑制濃度（MIC）的測(cè)定根據(jù)歐洲抗微生物藥物敏感委員會(huì)關(guān)于微生物對(duì)不同抗生素敏感閾值X的數(shù)據(jù)庫(kù)分析菌株的抗生素抗藥性。1 ng的DNA即可檢出?？偨Y(jié)與體會(huì)通過(guò)本次論文，我很好的總結(jié)了四年大學(xué)的學(xué)習(xí)，并將所學(xué)的知識(shí)很好的應(yīng)用到了實(shí)驗(yàn)中，對(duì)自己的理論應(yīng)用能力有了很好的鍛煉和提高。在此衷心的感謝向文良老師對(duì)我的幫助。從平板上分離得到的43株菌通過(guò)16S rRNA序列分析結(jié)果表明：有機(jī)白蘿卜表皮附生乳酸菌主要分為Pediococcus、Leuconostoc和Weissella屬（表6），其中，以LS5為代表的19株分離菌株屬于Pediococcus屬，它們的16S rRNA序列與P. pentosaceus DSM 20336T 的16S rRNA序列相似性為99%，因此以LS5為代表的19株菌被鑒定為P. pentosaceus，占所有菌株的44%；以LS2為代表的7株菌屬于Leuconostoc屬，它們的16S rRNA序列與L. mesenteroides ATCC 8293T的16S rRNA序列相似性為99%，因此以LS2為代表的7株菌被鑒定為L(zhǎng). mesenteroides，占所有菌株的16%；以LS15為代表的2株菌屬于Leuconostoc屬，它們的16S rRNA序列與L. pseudomesenteroides NRIC 1777T的16S rRNA序列相似性為99%，因此以LS15為代表的2株菌被鑒定為L(zhǎng). pseudomesenteroides，占所有菌株的5%；以LS26為代表的7株菌屬于Leuconostoc屬，它們的16S rRNA序列與L. citreum ATCC 49370T的16S rRNA序列相似性為99%，因此以LS26為代表的7株菌被鑒定為L(zhǎng). citreum，占所有菌株的16%；以LS34為代表的6株菌屬于Leuconostoc屬，它們的16S rRNA序列與L. holzapfelii LMG 23990T的16S rRNA序列相似性為99%，因此以LS34為代表的6株菌被鑒定為L(zhǎng). holzapfelii，占所有菌株的14%；以LS17為代表的2株菌屬于Weissella屬，它們的16S rRNA序列與W. cibaria LMG 17699T的16S rRNA序列相似性為100%，因此以LS17為代表的2株菌倍被鑒定為W. cibaria，占所有菌株的5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。(11) 為了增加質(zhì)粒的回收率，可將得到的溶液重新加入帶有吸附柱的Eppendorf管中，重復(fù)（10）的操作。Eppendoff管中剩余的400 μl重組大腸桿菌DH5α在4℃ 12000 rpm下離心 1 min，倒掉上清液約300 μl，微型震蕩儀上懸震菌體沉淀，吸取菌懸液涂于新的LB平板。 MRS液體培養(yǎng)基(1) 稱(chēng)取酵母粉 5g，蛋白胨 10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，吐溫80 1mL，檸檬酸銨2g，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g于1L的燒杯中；(2) 加入約800mL（80%）蒸餾水，加熱充分?jǐn)嚢枞芙猓?3) 滴加1mol/LNaOH，~；(4) 加蒸餾水至1L，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，分裝入試管中（5mL/支）；(5) 高溫高壓滅菌（121℃滅菌30min），保存。16S rRNA 基因片段一般有3 種分析方法: 第一種是，將PCR 產(chǎn)物與16S rRNA 種屬特異性的探針雜交，從而獲取微生物組成信息。乳酸菌還有分解脂肪的能力，三丁酸甘油酯易被乳酸菌發(fā)酵劑分解。然而，近年來(lái)越來(lái)越多抗生素抗藥性乳酸菌被發(fā)現(xiàn)具有一定可轉(zhuǎn)移的抗藥性，為乳酸菌的安全敲響了警鐘。 Regarding the Leuconostoc holzapfelii, 1 isolate was resistance。 蘿卜表皮附生乳酸菌乳酸菌（lactic acid bacteria）是一類(lèi)無(wú)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱(chēng)，它屬于發(fā)酵糖類(lèi)，其主要產(chǎn)物為乳酸。易溶于水，不溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下不穩(wěn)定。細(xì)菌主要是根據(jù)是細(xì)菌生理、生化性狀和形態(tài)特征進(jìn)行分類(lèi), 采用的對(duì)乳酸菌進(jìn)行純培養(yǎng)分離方法，然后鑒定其生理、生化、形態(tài)、反應(yīng)特征和免疫學(xué)特性[45]。 16S rRNA目的基因的PCR擴(kuò)增及克隆分析 16S rRNA目的基因的PCR擴(kuò)增(1) PCR引物Forward Primer：Eu27F(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，10μM )；Reverse Primer：1490R(5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′，10μM)；(2) PCR反應(yīng)16S rRNA 序列的PCR反應(yīng)體系（50μl）如表5表5 16S rRNA PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系PCR反應(yīng)試劑添加量滅菌水(ddwater) μl10Taq 緩沖液（冰上解凍）5 μldNTP( 冰上解凍)4 μlMgCl2（25mM）3μlForward Primer1 μlReverse Primer1 μl模板DNA2 μlTaq DNA 聚合酶(Tiangen，5 U/μl) μl按以下程序在PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀中對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)熱 5 min95℃變性1 min 50℃退火1 min 35 cycles72℃延伸2 min72℃延伸10 min反應(yīng)結(jié)束后，－20℃保存。12000 rpm離心10分鐘，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。STR的梯度稀釋濃度為2~1024μg/mL。 重組子的篩選和鑒定以Taq DNA聚合酶擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物末端都帶有單個(gè)堿基A，pGMT載體，其結(jié)構(gòu)圖譜如圖7所示，具有一個(gè)T堿基的粘性末端，它們既可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，將目的片段與載體相連，構(gòu)建成重組子。這次畢業(yè)設(shè)計(jì)既鍛煉了自己獨(dú)立思考的能力、與人合作的能力和應(yīng)對(duì)困難的心理，還在理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能上得到了提高。實(shí)驗(yàn)室的老師和師兄對(duì)待科學(xué)的嚴(yán)謹(jǐn)和鉆研精神讓我受益非淺，我將以后在的學(xué)習(xí)和生活中都本著嚴(yán)謹(jǐn)刻苦的精神進(jìn)行。圖7 pGMT結(jié)構(gòu)圖譜本實(shí)驗(yàn)采用了內(nèi)切酶EcoRⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行了切割，EcoRⅠ酶的切位點(diǎn)如圖8所示。3 結(jié)果 乳酸菌的分離乳酸菌是指發(fā)酵時(shí)能夠產(chǎn)生乳酸的一大類(lèi)細(xì)菌，包括40個(gè)屬，近300個(gè)種。室溫放置1~2分鐘，12000 rpm離心30 ~ 60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。DNA Marker VII 5 μl作標(biāo)準(zhǔn)，1 TAE緩沖液介質(zhì)，4 ~ 10 V/cm直流電電泳。有機(jī)蔬菜純天然、不含任何農(nóng)藥殘留，通常被稱(chēng)為“零污染”的蔬菜，因此備受消費(fèi)者青睞。 16S rRNA分析技術(shù)在乳酸菌分類(lèi)學(xué)的應(yīng)用16S ribosomal R