【正文】 門(mén)和 20個(gè)不同的屬 [19]。然而，微生物在實(shí)際土壤生境中的生長(zhǎng)與溫度、 pH 值、養(yǎng)分和種間的相互作用有很大關(guān)系，簡(jiǎn)單的人工模擬環(huán)境是無(wú)法滿足其生長(zhǎng)要求的。這種方法避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)法的缺陷，能比較客觀地評(píng)價(jià)微生物多樣性。 3) 基因指紋圖譜技術(shù) 基因指紋圖譜技術(shù)是基于基因在長(zhǎng)度、成分和結(jié)構(gòu)上的 多態(tài)性，利用電泳方法將復(fù)雜的 PCR 擴(kuò)增片斷分 離成簡(jiǎn)單的基因條帶圖譜，然后根據(jù)條帶信息進(jìn)行基因分析的技術(shù)。而生化特征一般分為糖（醇）類代謝、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝、碳氮源利用能力、磷酸酯酶和 DNA 酶、溶血酶和凝固酶等其他酶活性及抑菌能力等。一般認(rèn)為同種細(xì)菌之間 G+C 含 量差異不大于 3%，同屬種之間的差異不超過(guò) 10%，因此G+C 含量 測(cè)定在 判斷 細(xì)菌屬水平分類上的的意義較重要 [20]。 5 研究目的與意義 新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 16 上述研究初步對(duì)胡楊林極端環(huán)境下微生物類群進(jìn)行了研究 。 23′ 22″， B: N40176。 引物 表 1 擴(kuò)增 16S rRNA 基因序列所采用的引物及序列 新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 19 試驗(yàn)方法 樣品的預(yù)處理 將兩個(gè)采樣位點(diǎn)的胡楊莖桿液樣品以等比例混合，配成混合液樣。 5) 將染液用水小心沖洗， 至洗脫液無(wú)色 為止。 6) 鏡檢。 1400rpm離心 10min。得到的測(cè)序結(jié)果用 seqman 軟件包進(jìn)行拼接，在 genebank 中注冊(cè)序列，獲得注冊(cè)號(hào)。 3) 用報(bào)紙包好凍干管，報(bào)紙外做好名稱標(biāo)記，滅菌兩次。 11) 氧焰灼燒封口（全面轉(zhuǎn)動(dòng)凍干管，使其均勻受熱否則容易出現(xiàn)玻璃泡）。菌株從不同培養(yǎng)基中分離到的情況見(jiàn)圖 3。 出現(xiàn)頻率最高的屬為假單胞菌屬 (Pseudomonas)，獲得的 35 株假單胞菌分別屬于 Pseudomonas xinjiangensis、 Pseudomonas sabulinigri、 Pseudomonas azotifigens 0246810121416LB NB KB MA桿狀+桿狀—短桿狀+短桿狀—球狀+球狀—新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 27 和 Pseudomonas pelagia 等 4 個(gè)菌種， 占所有分離菌株的 % (35/80)。基于 16Sr RNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖 4— 圖 9。 出現(xiàn)頻率 其次 的 是 Rhizobium 屬和 Bacillus 屬，同樣都 占所分離菌株的% (9/80) (表 4)。 42′ 8″ E 85176。 結(jié)果 細(xì)菌的分離與純化 本研究從 Kiyik 河胡楊林胡楊莖桿液中通過(guò)采用 KB， LB， NB和 MA 等四種培養(yǎng)基，共分離得到了 63 株內(nèi)生細(xì)菌。 5) 準(zhǔn)備 17%的脫脂牛奶，在 120℃條件下滅 20 分鐘。 培養(yǎng)基優(yōu)勢(shì)度的計(jì)算 [44] 優(yōu)勢(shì)度指數(shù)計(jì)算公式為： D=N／ NT 。 9) 沉淀加 30μlTE， 20℃保存?zhèn)溆谩? 細(xì)菌基因組 DNA 的提取 裂解液法 [37]（方法一）： 1) 菌株在 10ml 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將 菌液 120xxrpm 離心5min，收集菌體。 7) 將制備好的樣片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察、記錄。選出生長(zhǎng)的菌落數(shù)在 20300 個(gè)范圍之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算出每種培養(yǎng)基的 CFU/ml值。 19′ 18″， C: N40176。 本研 究的目的是采集 kiyik 河古河道胡楊林胡楊莖桿液樣，經(jīng)過(guò)篩選得到純化菌株，用現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法對(duì)分離到的菌株進(jìn)行多相分類，以確定分離菌株的分類學(xué)地位，并采用 16S rRNA 基因序列基礎(chǔ)上進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，研究微生物的多樣性。 多相分類學(xué)研究中 通常兩株菌 DNA 同源性在70%以下可判斷其為不同的物種，而在 70%以上的同源性為同一種不同變種的細(xì)菌 [25]。關(guān)系密的菌株在一定生長(zhǎng)期，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)種類有很高的相似性。 3 細(xì)菌多相分類研究方法 [28] 表型特征分析法 細(xì)菌的表型分類依據(jù)主要是形態(tài)特征和不同實(shí)驗(yàn)條件 下的生長(zhǎng)情況及代謝特征。常用的微生物多樣性生物標(biāo)記法有 : 磷脂脂肪酸分析法 和呼吸醌指紋法。 2) 群落水平生理學(xué)指紋 ( CLPP) 或單一碳源利用模式法 ( SSCU) 是基于某一微生物群落所含有的酶可催化利用特定的碳源基質(zhì)，然后通過(guò)測(cè)定其利用能力和模式來(lái)評(píng)價(jià)微生物種群多樣性。在國(guó)內(nèi)河北大學(xué)生科院的 Jigang Han等人把毛竹根際，根表面和根內(nèi)組織作為樣品使用 2種培養(yǎng)基分離了 182株菌株，鑒定了屬于 22個(gè)屬的 56個(gè)不同的分類單元的 16S rDNA序列 [21]。 大量研究表明，植物內(nèi)生菌的種類、分布、定植都因植物種類不同而異。 Petrini[11]表明，某些內(nèi)生菌在寄主科水平上有專一性。內(nèi)生菌概念最早是由 De Bary在 1866年 提出， 他認(rèn)為 生活在植物組織內(nèi)的微生物 為 內(nèi)生菌 [5]，用以區(qū)分生活在植物表面的表生菌 （ Epiphyte） 。中國(guó)仍是當(dāng)今世界上胡楊分布范圍最廣、數(shù)量最多的國(guó)家。 Diversity?；诒硇吞卣?，化學(xué)分類特征和遺傳學(xué)特征分析結(jié)果，提議將菌株 KBL49 歸類為假單胞菌屬的一個(gè)新物種，并命名為 Pseudomonas Tograkense 。假單胞菌屬 (Pseudomonas)是占優(yōu)勢(shì)屬，占分離菌株的 % (35/80)。 碩士研究生學(xué)位論文 新 疆 大 學(xué) 論文題目（中文） ： Kiyik 河胡楊內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析及一株潛在新種的多相分類學(xué)鑒定 論文題目（外文）： Diversity of Endophytic Bacteria from the Populus euphratica in kiyik ancient river and taxonomic identification of a novel bacterium 研 究 生 姓 名： 布阿依夏姆 其中屬于 γ 變形菌的細(xì)菌為 49 株，占分離菌株的 %（ 49/80）；屬于厚壁菌門(mén)的細(xì)菌為 15 株，占分離菌株的 %（ 15/80）；屬于 α 變形菌綱的細(xì)菌為 10 株，占分離菌株的 %（ 10/80）；屬于放線菌門(mén)的細(xì)菌為 7 株，占分離菌株的 %（ 7/80）；屬于擬桿菌門(mén)的細(xì)菌為 1 株，占分離菌株的 %（ 1/80）。 主要脂肪酸組分有 C16:0、 Summed Feature C17:0 cyclo、 C19:0 cyclo w8c、 C12:0、 Summed Feature C12:0 3OH 和 C10:0 3OH。 endophytic bacteria。 胡楊林分布狀況 胡楊廣泛分布于阿爾及利亞，中國(guó)，埃及，印度，伊朗，伊拉克，以色列，利比亞，巴基斯坦，阿拉 伯?dāng)⒗麃喒埠蛧?guó)，土耳其，土庫(kù)曼斯坦等的近 20 個(gè)歐、亞、非洲國(guó)家。 2 植物內(nèi)生菌概況 植物內(nèi)生菌概念 植物內(nèi)生菌 一詞由希 臘語(yǔ)中的《 endo》（在 ? 之內(nèi)）和《 phyton》（植物）組成。 一些內(nèi)生菌只將一種植物作為宿主，而另一些則有多種宿主植物。研究表明，感染內(nèi)生菌的植物宿主往往具有生長(zhǎng)快速、抗逆境、抗 病害、抗動(dòng)物危害等優(yōu)勢(shì)，比未感染植株更具生存競(jìng)爭(zhēng)力 。 Anastasia Venieraki , Maria Dimou等人從希臘不同地區(qū)的小麥根際中分離了 17株可培養(yǎng)固氮菌，隸屬于 3個(gè)屬，并且研究促進(jìn)植物生長(zhǎng)的菌株的特性 [20]。因此，這種方法僅能培養(yǎng)出極少數(shù) ( 少于 1% ) 的微生物。方法的主要步驟是通過(guò)提取土壤微生物中的某種生化成分并純化，然后利用氣、液相色譜等化學(xué)手段對(duì)該種化學(xué)成分進(jìn)行分類鑒定。包括限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài) (restriction fragment length polymorphism， RFLP)、核糖體間隔區(qū)分析 ( ribosomal intergenic spacer analysis，RISA)、 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA( random amplified polymorphic DNA， RAPD)變性新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 14 劑濃度梯度凝膠電泳 (denaturing gradient gel electrophoresis， DGGE)、溫度梯度凝膠電泳 (temperature gradient gel electrophoresis， TGGE)、 時(shí)間溫度梯度凝膠電泳(temporal temperature gradient gel electrophoresis， TTGE)和 DNA 單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism， SSCP)等技術(shù)。 蛋白質(zhì)分析 [29] 研究蛋白質(zhì)組成差異最常用的方法是全細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)電泳分析。 DNADNA 同源性分析 核酸雜交技術(shù)，在 1960 年由 Marmur, Doty 等人 [30][31]首次提出， Carl L. Schildkraut 等人 [32]應(yīng)用于 DNADNA 同源性研究之后的大約 50 年里，被作為原核 生物物種鑒定界限的金標(biāo)準(zhǔn) [33]。 為了進(jìn)一步補(bǔ)充和完善干旱極端環(huán)境下微生物類群分布特性，全面系統(tǒng)的弄清胡楊林片區(qū)可培養(yǎng)細(xì)菌的類型，種群結(jié)構(gòu)，分布狀況，構(gòu)建菌種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，挖掘出一批當(dāng)?shù)匦戮N和罕見(jiàn)菌種，進(jìn)行目前 kiyik 河上游細(xì)菌分離鑒定以及多樣性分析的研究。 43′ 22″ E 85176。 細(xì)菌的分離與 CFU 值的計(jì)算 混合液樣 中取出 10ml， 添加至 90ml 滅菌過(guò)的生理鹽水中， 37℃下以 120rpm震蕩 25min， 以 稀釋涂布平板法 [35]分別涂布在 LB、 NA、 MA 和 KB 等四種培養(yǎng)基上 ，在 37℃下培養(yǎng) 2 到 7d。 6) 用吸水紙吸取多余水分，自然干燥。深紫色為革蘭氏陽(yáng)性，紅色為革蘭氏陰性細(xì)菌。 7) 上清加兩倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇， 14000rpm離心 7min. 8) 沉淀溶于 500μl 70%乙醇， 1000rpm 離心 2min，棄上清，干燥。在ezbiocloud 數(shù)據(jù)庫(kù)（ 親緣關(guān)系菌株的 16SrRNA 基因序列和 genebank 注冊(cè)號(hào)，通過(guò) ClustralX 程序進(jìn)行多序列匹配排列 [40]，并用 軟件包構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化矩陣跟軍 Kimura 雙參數(shù)模型估算 [41]，采用鄰近法（ neighborjoining method） [42]構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)，以 1000 自展重復(fù)次數(shù) [43]對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。 4) 滅一些移液管，竹簽，脫脂棉。 12) 將準(zhǔn)備好的凍存管在 4℃保存。 圖 3 菌株在 不同培養(yǎng)基上 的 生長(zhǎng)情況 基于 16S rRNA 基因序列基礎(chǔ)上的系統(tǒng)發(fā)育分析 從 kiyik 河 GPS 位點(diǎn)為（ N40176。 其中 的Pseudomonas xinjiangensis 為 優(yōu)勢(shì)種 ， 共 有 22 株（表 4）。 表 4 Kiyik 河胡楊可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu) 及 16SrDNA 序列同源性 Strainr Phylum Genera Similarity bacteria Similarity KBN13 Actinobacteria Microbacterium Microbacterium hydrocarbonoxydans DSM 16089(T) KBN14 Microbacterium hydrocarbonoxydans DSM 16089(T) KBL41 Microbacterium sedminis YLB01(T) KBL47 Nesterenkonia Nesterenkonia aethiopica DSM 17733(T) KBL42 Nesterenkonia suensis SuaBAC020(T) KBN119 Nesterenkonia suensis SuaBAC020(T) KBL415X Nocardioides Nocardioides alkalitolerans KSL1(T) KBM23p Alphaproteobacteria Rosomonas Resomonas aestuarii JC17(T) KBN420 Rhizobium Rhizobium rosettiformans W3(T) KBK311 Rhizobium rosettiformans W3(T) KBK313 Rhizobium rosettiformans W3(T) KBK43 Rhizobium rosettiformans W3(T) KBK638 Rhizobium rosettiformans W3(T) KBL45x Rhizobium rosettiformans W3(T) KBL538 Rhizobium rosettiformans W3(T) KBK538 Rhizobium rosettiformans W3(T) KBN18 R