【正文】 時一般采用的是飽和濕度，目的是減少培養(yǎng)基內(nèi)的水分蒸發(fā)，從而維持培養(yǎng)基中卵母細(xì)胞所需要的各種物質(zhì)的濃度及保持滲透壓。排卵之前，卵丘細(xì)胞擴(kuò)展，合成大量胞外基質(zhì)，并富含透明質(zhì)酸（Hyaluronic：HA），有利于排卵后進(jìn)入輸卵管，同時保證了卵母細(xì)胞正常的受精和胚胎發(fā)育潛力，所以，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)張對卵母細(xì)胞成熟，特別是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟起著重要作用。 一般而言，卵巢離體的時間要求在2~4h 內(nèi)，時間越短，所獲得的卵母細(xì)胞的質(zhì)量越好，體外成熟培養(yǎng)的效果也越好。不同的國家和地區(qū)之間，豬的品種必定存在著遺傳因素、飼養(yǎng)環(huán)境和氣候條件等等的因素而帶來品質(zhì)上的差異，從而影響豬卵母細(xì)胞的質(zhì)量進(jìn)而對體外成熟培養(yǎng)也產(chǎn)生一定的影響。隨著卵母細(xì)胞的成熟，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，而滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，到成熟晚期，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變得很少。核成熟是核膜破裂，同源染色體分離和排出第一極體；胞漿成熟是胞漿內(nèi)各種蛋白組成達(dá)到一定水平及線粒體的有效重排。燕山大學(xué)課 程 設(shè) 計 說 明 書卵丘細(xì)胞對豬卵母細(xì)胞體外成熟影響的設(shè)計學(xué)院（系）： 年級 專業(yè)： 0 學(xué) 號： 學(xué)生 姓名： 指導(dǎo) 教師： 教師 職稱： 燕山大學(xué)課程設(shè)計（論文）任務(wù)書院（系）： 基層教學(xué)單位： 學(xué) 號學(xué)生姓名專業(yè)（班級）設(shè)計題目卵丘細(xì)胞對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響設(shè)計主要內(nèi)容設(shè)計要求，,設(shè)計合理的操作方式工作量工作計劃 查閱資料 整理文獻(xiàn) 設(shè)計方案 撰寫說明書 檢查內(nèi)容準(zhǔn)備答辯參考資料[1] 陳大元. 受精生物學(xué)[M]. 北京科學(xué)出版社, 2000, 51: 147148.[2] 王海, 曾申明, 朱士恩. 培養(yǎng)介質(zhì)、卵丘細(xì)胞和卵泡直徑對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響[J]. 中國畜牧雜志, 2002, 38: 1516.[3] 錢云, 丁家桐, 劉紅林. 卵母細(xì)胞成熟的形態(tài)學(xué)特征及其調(diào)控[J]. 國外畜牧科技, 2001, 26: 2630.指導(dǎo)教師簽字基層教學(xué)單位主任簽字說明：學(xué)生、指導(dǎo)教師、基層教學(xué)單位各一份。 關(guān)鍵詞：卵丘細(xì)胞；豬卵母細(xì)胞；體外成熟燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計 說 明 書目 錄第一部分 文獻(xiàn)綜述 1 1 1 12. 影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的因素 2 2 卵巢來源豬的年齡、品種及健康狀況 2 2 3 3 3 體外成熟培養(yǎng)條件 4 4 4 4 4 5 5 6 6 7 7 8 9 10第二部分 課程設(shè)計部分 11 11 卵巢 11 實(shí)驗(yàn)用的儀器 11 實(shí)驗(yàn)試劑 12 12 卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）的收集 12 12 13 133. 設(shè)計 13 13 13 14 14 14 15參考文獻(xiàn) 16燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計 說 明 書第一部分 文獻(xiàn)綜述卵母細(xì)胞成熟是指卵母細(xì)胞恢復(fù)和完成第一次減數(shù)分裂，進(jìn)入并停滯于第二次減數(shù)分裂中期，此間伴隨著胞漿成熟，即卵母細(xì)胞的成熟包括其核成熟和胞漿成熟兩個方面[v]。發(fā)育早期的線粒體為圓形或橢圓形等，主要分布于皮質(zhì)部，卵母細(xì)胞成熟后，線粒體又移向核周圍，形成幼稚型線粒體。從初情期前的青年母豬卵巢中獲得的豬卵母細(xì)胞經(jīng)過體外成熟培養(yǎng)后可得到IVP 后代，但是，成功的效率不如經(jīng)產(chǎn)母豬卵巢體外成熟的卵母細(xì)胞。因此，卵巢所處性周期不同，卵泡內(nèi)的能量物質(zhì)、激素濃度等也會隨之而發(fā)生變化，進(jìn)而影響了體外成熟培養(yǎng)的結(jié)果。大多數(shù)哺乳動物的卵母細(xì)胞被卵丘細(xì)胞包裹形成COCs）。 體外成熟培養(yǎng)條件溫度 不同動物的卵母細(xì)胞所需要的體外成熟培養(yǎng)溫度因動物種類的不同而不同，豬所需要的溫度一般為38℃~39℃較為適宜，過高或過低都不利于細(xì)胞的發(fā)育。不同動物的卵母細(xì)胞所需要的體外成熟培養(yǎng)時間因動物種類的不同而有所不同，大多數(shù)哺乳動物所需要的體外培養(yǎng)時間為22~24h，但是對豬而言，卻需要更長的時間，一般，豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的時間為44h。目前豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液以TCM199和NCSU23使用較多。尤其對于LH 的添加存在爭議，有研究者認(rèn)為LH 在卵母細(xì)胞培育過程中并未發(fā)揮作用，Izadyar 等認(rèn)為在不含血清的成熟培養(yǎng)液中，只有FSH 能影響卵母細(xì)胞的成熟，而LH 沒有作用；Bevers 等認(rèn)為小于8mm 的牛卵泡中，顆粒細(xì)胞上只有FSH 受體mRNA，而沒有LH 受體mRNA。雖然血清對于豬卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)有較好的促進(jìn)作用，但是血清也有其本身固有的不利因素，如血清中所含有的激素、維生素、細(xì)胞因子、生長因子，以及許多未知物質(zhì)，并且容易被支原體感染。目前已經(jīng)證實(shí)，EGF 可以促進(jìn)豬卵母細(xì)胞的核成熟。 卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞在卵母細(xì)胞成熟過程中的結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟與其周圍的卵泡細(xì)胞的作用是分不開的。處于成熟階段的卵母細(xì)胞，卵丘細(xì)胞通過大量充滿肌纖維蛋白的帶狀結(jié)構(gòu)緊密包裹著透明帶，保持卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間縫隙聯(lián)系，進(jìn)行離子交換和一些小的代謝物質(zhì)的交換。因而卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞成熟的啟動似乎并不起主導(dǎo)作用，應(yīng)該只能認(rèn)為是起加強(qiáng)或減弱的輔助作用。卵丘擴(kuò)展常用作判斷卵母細(xì)胞體外成熟的特征，Hunter和Moor根據(jù)卵丘細(xì)胞擴(kuò)展情況制定了牛卵母細(xì)胞體外成熟的判斷標(biāo)準(zhǔn)：1級成熟卵為“卵丘細(xì)胞完全擴(kuò)展”；卵丘細(xì)胞團(tuán)至少擴(kuò)展倍于裸卵直徑（300181。卵丘擴(kuò)展對牛卵母細(xì)胞體外成熟不是必需的。具有多層的卵丘細(xì)胞（致密或分散）的卵母細(xì)胞55％以上到達(dá)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)雙線期，具有體外發(fā)育完全的最大潛力。盡管目前卵丘擴(kuò)展程度可作為卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志之一，但卵丘擴(kuò)展對卵母細(xì)胞體外成熟不是必需的。盡管動物卵母細(xì)胞能夠在體外自發(fā)完成細(xì)胞核成熟，但卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量遠(yuǎn)不如體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞，其受精后胚胎發(fā)育能力較差。豬宰殺剖腹后，立即無菌剪下卵巢，挑選黃體期和紅體較少，卵泡直徑約3~5 mm、大小均勻的卵巢，使用37 ℃的PBS緩沖液沖洗干凈，置于37 ℃的PBS緩沖液4h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。%胎牛血清的DPBS洗滌3次，然后用成熟培養(yǎng)液洗滌3次，最后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計分別移入含有成熟培養(yǎng)液滴的直徑35mm培養(yǎng)皿中。探索卵丘細(xì)胞層數(shù)的多少對豬卵母細(xì)胞成熟的影響的大小。本設(shè)計重點(diǎn)研究了卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞體外成熟過程中的作用，初步篩選了有卵丘細(xì)胞和無卵丘細(xì)胞兩種情況下，卵母細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，并且進(jìn)一步研究卵丘細(xì)胞的不同形態(tài)對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響，為提高卵母細(xì)胞的體外成熟效率提供了依據(jù)，將有助于更好的利用卵母細(xì)胞來為胚胎工程乃至克隆技