【正文】 依賴 DNA識別域的 特異性：效率高 有脫靶現象，專利被Ｓａｎｇａｍｏ壟斷 基因敲除的方法 ? TALE domain: DNA 識別域 ? TALE， 植物病原體 黃單胞 菌 Xantomonas – 用于調控宿主基因 ? 由 34的氨基酸長度的重復單位構成 ? 第 12， 13位點氨基酸（ repeatvariable diresidue， RVD）不同 ? RVD決定識別位點不同 ? Nuclease domain: DNA剪切域 ? FokI，發(fā)現于 海床黃桿菌 Flavobacterium okeanokoites ? 采取其非特異性 DNA剪切結構域 ? 形成二聚體時發(fā)生剪切 N’ C’ TALE FokI LTPDAVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHG NI → A HD → C NG → T NN → G A T T C T G C T A A C T C A T A C 新的里程碑技術 ： TALEN (transcription activatorlike effector nuclease， 2022年底 ) TALEN切割雙鏈 5’ 5’ 3’ 3’ 左臂 右臂 FokI 聚合 DSB Double strand Break Nonhomologous End Joining (NHEJ) Homologous Rebination (HR) 無模板 有模板 Gene Disruption Gene insertion Gene replacement Forward geics（自然突變、化學誘變、插入誘變等） RNAi 同源重組 鋅指 核酸酶（ ZFN） TALEN 突變效率 低 較高 低 低 高 特異性 低 高 高 高 高 毒性 高 低 低 高 低 穩(wěn)定性 高 低 高 高 高 實驗周期 短 短 長 短 短 TALEN取代了過去 構建 TALEN質粒 如何將這些高度重復的 DNA片段連接起來？ TALEN的組裝 (Golden Gate) PCR 3步 Digest 2步 Ligate 2步 一步法連接 只要 45小時，這些片段就全部連接起來了 一步連接 1 2 3 6 5 4 9 13 7 10 12 16 8 14 11 15 17 18 FastTALETM連接 TALEN N’ C’ N’ C’ TALEN modules at 9 positions TALEN backbone vectors TALEN assembled vectors Promoter FokI Promoter FokI x4 x16 x4 x16 x4 x16 x4 x16 x4 x16 x4 x16 x16 x16 x4 x16 Position 1 Position 2 Position 3 Position 4 Position 5 Position 6 Position 7 Position 8 Position 9 1/2 9 x 12 dimers, 7 x 4 monomers Complete library: 172 CMV, EF1a, Ubi, 35S, T7, SP6 Maximum RVDs: 19 Minimum RVDs: 12 多種 TALEN骨架載體，滿足不同物種需求 第一組載體： 干細胞 專用打靶載體，采用 EF1α啟動子。 第四組載體： 植物 專用打靶載體，采用 ubiqutin或 35s啟動子。 思路 2: 在 miRNA前體 發(fā)夾結構 的 上下游處 分別設計一對 TALEN，利用 TALEN將包含 發(fā)夾結構 在內 的 DNA片段剪切致缺失，從而實現對 miRNA的敲除。 技術革新推動科研進步 上海斯丹賽生物技術有限公司 市場部： 02158959719 技術支持： 02138723968 做科研很難 做 TALEN不難 TALEN盡在斯丹賽 謝謝！