【正文】 來(lái)核酸片段，插入后不影響其進(jìn)入宿主細(xì)胞和在細(xì)胞中的復(fù)制4. 有容易被識(shí)別篩選的標(biāo)志5. 容易從宿主細(xì)胞中分離純化出來(lái)質(zhì)粒：獨(dú)立于細(xì)菌染色體以外的遺傳物質(zhì)，能夠自我復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子★質(zhì)粒的特點(diǎn)1. 大多數(shù)質(zhì)粒DNA是是環(huán)狀雙鏈的DNA分子 2. 復(fù)制類(lèi)型分為嚴(yán)緊型和松弛型3. 有共價(jià)閉合環(huán)形、開(kāi)環(huán)和線(xiàn)性三種構(gòu)型4. 泳動(dòng)速度：SCDNA LDNA OCDNA5. 質(zhì)粒具有不相容性6. 具有轉(zhuǎn)移現(xiàn)象和遷移作用l 噬菌體載體216。 優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物可進(jìn)行翻譯后修飾與加工216。 細(xì)菌人工染色體(BACs): F質(zhì)粒，供體DNA300kb,用于大基因組分析216。羥基末端磷酸化、或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3’羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸內(nèi)切酶具有識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶Ⅰ型：修飾酶活性和依賴(lài)于ATP的限制性?xún)?nèi)切酶活性 Ⅱ型：內(nèi)切酶活性和修飾酶活性，專(zhuān)一性強(qiáng)。 Cys2/Cys2③ 亮氨酸拉鏈(bZIP):252。功能不受距離和取向的限制應(yīng)答元件:能和專(zhuān)一性蛋白因子結(jié)合，用以調(diào)控真核生物細(xì)胞處于某一特定環(huán)境時(shí)基因表達(dá)的DAN上游序列。不可逆216。這一過(guò)程稱(chēng)為誘導(dǎo)。基因表達(dá)調(diào)控的類(lèi)型正調(diào)控：調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白，調(diào)控因子通過(guò)與啟動(dòng)子元件結(jié)合來(lái)激活基因的表達(dá)。是mRNA與核蛋白體識(shí)別、結(jié)合的位點(diǎn)真核生物mRNA的特點(diǎn)真核生物沒(méi)有SD序列，靠帽子結(jié)構(gòu)識(shí)別核糖體真核生物的起始密碼位于Kozak序列（CCACCAUGG）中，增加翻譯起始的效率大亞基P位(peptidyl site) ：結(jié)合肽酰tRNA的部位A位(aminoacyl site) ：結(jié)合氨基酰tRNA的部位E位(exit site) ：排出位蛋白質(zhì)的生物合成的過(guò)程（一）原核生物翻譯起始① 核蛋白體大小亞基分離—起始因子 IF3 、IF1介導(dǎo)，利于小亞基與mRNA，fMettRNAfMet結(jié)合② mRNA在小亞基定位結(jié)合—通過(guò)5’端SD序列(AGGA)配對(duì)結(jié)合到核蛋白體小亞基上的16SrRNA近3’末端處(UCCU)③ 起始氨基酰tRNA的結(jié)合—fMettRNAifMet和IF2及GTP形成復(fù)合物④ 核蛋白體大亞基結(jié)合—70S起始復(fù)合物形成起始因子IF和eIF原核：起始因子—— 三種； IFl、2和3 真核：起始因子—— 十種； eIF 翻譯起始： 1）IF3 —結(jié)合核蛋白體30S亞基，使大、小亞基拆離 2）IF1協(xié)助IF3結(jié)合和亞基拆離 3）單獨(dú)的30S亞基易于與mRNA及起始tRNA結(jié)合 4）IF2促進(jìn)fMettRNA結(jié)合mRNA及核蛋白體（二）真核生物翻譯起始復(fù)合物形成1. 起始因子eIF3結(jié)合到核糖體（80S）的小亞基（40S）上，使大亞基（60S）與小亞基解離2. 甲硫酰tRNA（ MettRNAimet ）結(jié)合3. mRNA結(jié)合（需帽結(jié)合蛋白CBP）肽鏈延長(zhǎng)在核蛋白體上連續(xù)性循環(huán)式進(jìn)行，又稱(chēng)為核蛋白體循環(huán)，每次循環(huán)增加一個(gè)氨基酸l 進(jìn)位(entrance)/注冊(cè)（registration）l 成肽(peptide bond formation)l 轉(zhuǎn)位(translocation)延長(zhǎng)因子EFG有轉(zhuǎn)位酶活性，促進(jìn)mRNA肽酰tRNA由A位前移到P位，促進(jìn)卸載tRNA釋放蛋白質(zhì)生物合成的調(diào)節(jié)1. 閱讀框架的漂移、重疊和5’AUG的作用2. 翻譯錯(cuò)誤：氨基酰合成酶校正3. RNA的結(jié)構(gòu)：帽子、poly (A)尾、空間結(jié)構(gòu)4. 蛋白質(zhì)生物合成阻斷劑：① 抗生素類(lèi)—大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、氯霉素、氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素② 抗代謝藥物—抗腫瘤藥③ 其他生物活性物質(zhì)—白喉毒素、干擾素分子伴侶一類(lèi)在序列上沒(méi)有相關(guān)性但有共同功能的蛋白質(zhì)。3）內(nèi)含子5’端有一保守序列5’GUAAGUA3’，和剪接體中U1 snRNA的5’端的3’CAUUUCAU5’互補(bǔ)。原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工1，mRNA: 轉(zhuǎn)錄生成的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本mRNA不需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的加工過(guò)程即可表現(xiàn)功能。不影響轉(zhuǎn)錄起始但對(duì)轉(zhuǎn)錄效率十分重要(大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識(shí)別的啟動(dòng)子區(qū)) 圖★真核生物啟動(dòng)子RNA聚合酶I的啟動(dòng)子 1．核心啟動(dòng)子（core promoter），由45～+20位核苷酸組成，單獨(dú)存在時(shí)就足以起始轉(zhuǎn)錄。 2．移碼突變（frameshift mutation）：指DNA片段中某一位點(diǎn)插入或丟失一個(gè)或幾個(gè)（非3或3的倍數(shù)）堿基對(duì)時(shí)，造成插入或丟失位點(diǎn)以后的一系列編碼順序發(fā)生錯(cuò)位的一種突變。有兩個(gè)終止區(qū)域，需要tus基因的產(chǎn)物識(shí)別終止區(qū)信號(hào)序列，阻止復(fù)制叉繼續(xù)前進(jìn)②線(xiàn)狀DNA分子的復(fù)制終點(diǎn)：串聯(lián)體模型 DNA復(fù)制的酶學(xué)： ①解旋酶(helicase)：通過(guò)ATP獲能，沿5‘→3’方向解開(kāi)DNA雙鏈②單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrand binding protein, SSB):單鏈DNA結(jié)合，阻止其再形成雙鏈體狀態(tài)③拓?fù)洚悩?gòu)酶 （DNA Topisomerase ）：催化DNA拓?fù)洚悩?gòu)體相互轉(zhuǎn)換，松弛超螺旋(DNA polymerase)①大腸桿菌DNA聚合酶 I：★三種活性539。③結(jié)果是在原來(lái)的位置上丟失了轉(zhuǎn)座因子，而在插入位置上增加了轉(zhuǎn)座因子，可造成表型的變化。2基因組中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)3基因是連續(xù)的，沒(méi)有內(nèi)含子4功能相關(guān)的基因高度集中構(gòu)成操縱子5DNA大部分是用于編碼蛋白質(zhì)6編碼蛋白質(zhì)的基因通常為單拷貝7結(jié)構(gòu)基因的重復(fù)序列少8基因組中存在可移動(dòng)的DNA序列 ★真核生物基因組特點(diǎn)1真核基因組的復(fù)雜性：基因組大、主要的遺傳物質(zhì)與組蛋白等構(gòu)成染色質(zhì)，被包裹在核膜內(nèi)，核外還有遺傳成分(如線(xiàn)粒體DNA等)2真核生物是一個(gè)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，即mRNA是單順?lè)醋?，基本上沒(méi)有操縱子的結(jié)構(gòu)3結(jié)構(gòu)基因所占區(qū)域遠(yuǎn)小于非編碼區(qū)4結(jié)構(gòu)基因大多為斷裂基因，即有外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)，轉(zhuǎn)錄后需經(jīng)剪接去除內(nèi)含子，才能翻譯獲得完整的蛋白質(zhì)5基因組中存在大量重復(fù)序列 高度重復(fù)序列：①反向重復(fù)序列：兩個(gè)相同順序的互補(bǔ)拷貝在同一DNA鏈上反向排列而成，與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的調(diào)控有關(guān)。 結(jié)構(gòu)畸變：缺失、重復(fù)、倒位、易位 基因 (Gene) 是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位。1染色單體：中期染色體由兩條染色單體組成，兩者在著絲粒的部位相互結(jié)合，每一條染色單體是由一條DNA雙鏈經(jīng)過(guò)螺旋和折疊而形成的。 tRNA 在翻譯過(guò)程中的轉(zhuǎn)接分子。一條鏈的走向從5’到3’，另一條鏈的走向從3’到5’。 DNA雙鏈呈反向平行。 hnRNA mRNA剪接前體。單鏈、雙鏈和逆轉(zhuǎn)錄病毒第二章 染色質(zhì)、染色體、基因和基因組染色質(zhì)(chromatin) ：是指細(xì)胞周期間期細(xì)胞核內(nèi)由DNA、組蛋白、非組蛋白和少量RNA組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)染色體(chromosome)：是指在細(xì)胞分裂期出現(xiàn)的一種能被堿性染料強(qiáng)烈染色，并具有一定形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征的物體。染色體畸變 是因?yàn)橄忍煨匀旧w數(shù)目異?；颍ê停┙Y(jié)構(gòu)畸變數(shù)目畸變：整倍體 ：增加或減少整套的染色體 ① 多倍體 ② 三倍體非整倍體：增加或減少一條或幾條染色體 ①缺體 ②單體 ③三體 ★原核生物基因組特征1基因組通常僅由一條雙鏈DNA組成。 （3）靶位點(diǎn)存在 59 bp 的短正向重復(fù)序列 （4）作為一個(gè)整體進(jìn)行轉(zhuǎn)座2復(fù)合轉(zhuǎn)座子 (Composite transposon)：包含有轉(zhuǎn)座非必需基因的中央?yún)^(qū)和兩側(cè)兩個(gè)IS (1)中間區(qū)域含編碼轉(zhuǎn)座酶以外的標(biāo)記基因； (2)兩端具有插入序列； (3)兩末端是反向重復(fù)序列； (4)靶位點(diǎn)存在短正向重復(fù)序列 (5)可以作為一個(gè)整體進(jìn)行轉(zhuǎn)座；含有的一個(gè)或兩個(gè)IS元件也可進(jìn)行單獨(dú)轉(zhuǎn)座 （transposon A, Tn A）長(zhǎng)約5kb左右，兩端具有ITR，而不是IS，中部的編碼區(qū)不僅編碼抗性標(biāo)記，還編碼轉(zhuǎn)座酶和解離酶：以溶菌和溶源周期性交替生長(zhǎng)的溫和噬菌體①含有與轉(zhuǎn)座有關(guān)的基因和反向重復(fù)序列 ②能夠整合進(jìn)寄主染色體，催化一系列染色體的重新排列 轉(zhuǎn)座作用的機(jī)制1增殖：在基因組中增加轉(zhuǎn)座因子的拷貝數(shù)2步驟： ①供體剪切：使轉(zhuǎn)座因子從宿主DNA中分離出來(lái) ②鏈交換：轉(zhuǎn)座酶催化使轉(zhuǎn)座子與靶位點(diǎn)相連 ③修復(fù)：以DNA合成反應(yīng)填補(bǔ)缺口3靶位點(diǎn)的重復(fù)制：修復(fù)缺口的同時(shí)產(chǎn)生同向重復(fù)序列 轉(zhuǎn)座的三種類(lèi)型知道1復(fù)制型轉(zhuǎn)座(replicative transposition)①轉(zhuǎn)座因子在轉(zhuǎn)座期間先復(fù)制一份拷貝，而后拷貝轉(zhuǎn)座到新的位置，在原先的位置上仍然保留原來(lái)的轉(zhuǎn)座因子 ②有轉(zhuǎn)座酶和解離酶的參與 2非復(fù)制型轉(zhuǎn)座(Nonreplicative transposition)①轉(zhuǎn)座因子直接從原來(lái)位置上轉(zhuǎn)座插入新的位置，并留在插入位置上②轉(zhuǎn)座只需轉(zhuǎn)座酶的作用。：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開(kāi)始的，這一部位叫做復(fù)制起點(diǎn)(ori ) ★：DNA復(fù)制從起始點(diǎn)開(kāi)始直到終點(diǎn)為止，每個(gè)這樣的DNA單位稱(chēng)為復(fù)制子 ：DNA分子復(fù)制是復(fù)制起始點(diǎn)兩條鏈解開(kāi)成單鏈，分別做模板各自合成其互補(bǔ)鏈所形成的Y形結(jié)構(gòu)：①雙向復(fù)制：從原點(diǎn)開(kāi)始在兩個(gè)方向各有一個(gè)復(fù)制叉在延伸，直至與臨近的復(fù)制叉匯合②單向復(fù)制：：①環(huán)狀DNA復(fù)制終點(diǎn)：兩個(gè)復(fù)制叉進(jìn)行到特殊的終止位點(diǎn)復(fù)制終止。點(diǎn)突變分轉(zhuǎn)換和顛換兩種形式。 35區(qū)：TTGACA區(qū)，與RNA聚合酶的σ因子相互識(shí)別35 和10區(qū)域之間的間隔17bp最佳。真核生物mRNA為單順?lè)醋?，即只含一個(gè)基因，一個(gè)mRNA分子編碼一種蛋白質(zhì)分子。2）分枝點(diǎn)順序：內(nèi)含子3′端上游1840nt處，Py80NPy87Pu75APy95，A具有2’OH。兩個(gè)密碼子之間無(wú)任何核苷酸隔開(kāi)開(kāi)放閱讀框(ORF): 從起始密碼AUG到終止密碼處的正確可閱讀序列原核生物mRNA的特點(diǎn)SD序列：原核生物mRNA起始密碼AUG上游8~13核苷酸處，存在一段5’UAAGGAGG3’的保守序列，稱(chēng)為SD序列?！锓词阶饔靡蜃樱阂粋€(gè)基因的產(chǎn)物(蛋白質(zhì)或RNA) ，通過(guò)與特異的順式作用元件相互作用，對(duì)另一個(gè)基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，操縱子結(jié)構(gòu)基因才開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，翻譯出大量的酶。 染色質(zhì)的丟失：在細(xì)胞分化過(guò)程中，某些原生動(dòng)物、線(xiàn)蟲(chóng)、昆蟲(chóng)等體細(xì)胞通過(guò)丟失某些基因而除去這些基因的活性。當(dāng)其DNA序列與特異蛋白因子結(jié)合后，可阻斷轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成和活化，使基因表達(dá)的活性受到抑制。 兩種類(lèi)型：Cys2/His2。 3. 重組DNA分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞：重組DNA分子引入受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增4. 重組體的篩選與鑒定：直接篩選法(如抗藥標(biāo)志選擇)和免疫學(xué)方法5. 目的基因的表達(dá)及分離純化：原核與真核表達(dá)基因工程相關(guān)酶學(xué)酶功 能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ1）合成雙鏈cDNA的第二條鏈；2）缺口平移制作高比活探針 3）DNA序列分析 4）填補(bǔ)3’末端反轉(zhuǎn)錄酶1）合成cDNA 2）替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)、標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸539。 特點(diǎn)① 雙鏈DNA分子（線(xiàn)性或環(huán)形）② 兩端具有12個(gè)nt單鏈互補(bǔ)粘性末端③ 具非必需區(qū)（中間區(qū)約1/3長(zhǎng)度）④ ⑤ 可克隆15Kb左右的外源基因大容量載體216。 缺點(diǎn)：表達(dá)量相對(duì)較低 ，培養(yǎng)周期長(zhǎng)、要求高27 / 27