【正文】 析 、 βD葡糖醛酸糖苷酶的化學(xué)發(fā)光分析 熒光素酶分析 。 四 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 三個(gè)功能區(qū) 。 分子鑒定 ： RFLP鑒定、 RAPD標(biāo)記鑒定。 第一類是 裸露的或休眠的繁殖體，適當(dāng)干燥的體細(xì)胞胚、休眠的微鱗莖和微塊莖等 第二類 為人工種皮包被的繁殖體，一些體細(xì)胞胚、原球莖等 海藻酸鈉作包埋 第三類是水凝膠包埋再包被人工種皮的繁殖體，大多數(shù)體細(xì)胞胚、不定芽、莖尖等 人工種子 細(xì)胞分裂與細(xì)胞壁再生 愈傷組織形成 愈傷組織分化 植株再生 （五）、 愈傷組織形成和植株再生 ? 變異 頻率， ?2. 細(xì)胞工程技術(shù) 進(jìn)行 遺傳重組 的 材料 ， 細(xì)胞融合和基因轉(zhuǎn)移 必需在原生質(zhì)體上進(jìn)行。原生質(zhì)體在良好的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)分裂，細(xì)胞壁再生，形成愈傷組織，誘導(dǎo)愈傷組織分化，長(zhǎng)出莖、葉，根而形成植株。 六、 植物細(xì)胞的 培養(yǎng)技術(shù) 的培養(yǎng) ?（ 1） 看護(hù)培養(yǎng)法 （ nurse culture）：在單細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境里加入愈傷組織同時(shí)培養(yǎng)。 混合 將融化的瓊脂和母液充分混合，用蒸餾水定容到1000ml，來回混合幾次。 注意： 所有母液都要貼上標(biāo)簽，注明名稱、配制倍數(shù)、日期，所有的母液都應(yīng)保存在 0~4℃ 冰箱中，若母液出現(xiàn)沉淀或霉團(tuán)則不能繼續(xù)使用。培養(yǎng)基中的有機(jī)成分原則上應(yīng)分別單獨(dú)配制。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配制 1L培養(yǎng)基，取微量 Ⅰ 10ml，微量 Ⅱ １ ml 鐵鹽母液的配制 鐵鹽不是都需要單獨(dú)配成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。2H2O時(shí)，蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的 CO2，以防沉淀。后用蒸餾水定容到 1000ml的容量瓶中，即為 10倍的大量元素母液。 （ 3）植物細(xì)胞好氣，培養(yǎng)過程 需供氣及攪拌 ， （ 4）植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大得多，纖維素細(xì)胞壁，細(xì)胞壁脆弱，抗剪切能力小，傳統(tǒng)的攪拌式反應(yīng)器極易損傷細(xì)胞壁 三、植物細(xì)胞的培養(yǎng)特點(diǎn) ?（ 5）具有群體效應(yīng)、無錨定依賴性及接觸抑制性； ?（ 6）培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，且產(chǎn)量較低； ?（ 7）培養(yǎng)過程具有結(jié)構(gòu)與功能全能性。 ? 已分化細(xì)胞要表現(xiàn) 全能性 ，先要脫分化成 分生細(xì)胞 ，后再分化形成胚胎發(fā)育成植株 ? 脫分化條件： 創(chuàng)傷和外源激素 。 White、 Gautheret、 Nobecourt 等科學(xué)家被譽(yù)為植物組織培養(yǎng)的奠基人。 1925年， Laibach 進(jìn)行亞麻種間雜種幼胚培養(yǎng)，成功地得到了雜種植物。 1937年， White 和 Went 等分別發(fā)現(xiàn) B族維生素和吲哚乙酸（ IAA）對(duì)培養(yǎng)的離體根生長(zhǎng)具有重要作用。 一 .植物細(xì)胞工程 基本概念 ： ? 原理和方法 ：細(xì)胞學(xué)、 生理學(xué) 、 分子生物學(xué)及工程學(xué)原理 ? 對(duì)象： 植物細(xì)胞 ? 設(shè)計(jì)改造 ： 植物細(xì)胞遺傳性 ? 目標(biāo)： 創(chuàng)造新物種，提供名貴藥品及服務(wù) 二 .植物細(xì)胞工程 研究主要內(nèi)容 ： ? 植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù) ? 原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合技術(shù) ? 植物的快速繁殖和人工種子 ? 植物染色體工程 ? 轉(zhuǎn)基因技術(shù) 植物細(xì)胞工程 熱點(diǎn) ? ，采用 植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)植物的細(xì)胞，組織，器官 以獲得有 藥用價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物 。 延遲期 ： 細(xì)胞數(shù)恒定，高 RNA含量，高蛋白質(zhì)合成能力； ?加速期 ： 細(xì)胞快速生長(zhǎng)期。 ?（ 5）需有機(jī)物：甘氨酸或水解絡(luò)酪蛋白，酵母提取液等。 注意： (1) 某些無機(jī)成分如 Ca2+、 SO42一 、 Mg 2十 和 H2PO4一 等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。 ２、微量元素母液的配制 MS培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機(jī)鹽由 7種化合物（除 Fe）組成。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。 配制生物素、葉酸，用稀氨水溶解，然后定容。 ?凡 花藥 培養(yǎng)中常用培養(yǎng)基 ， 成分較簡(jiǎn)單 ， 且 KN03和(NH)2N04含高。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。 的培養(yǎng) 指將植物單倍體細(xì)胞 花藥 培養(yǎng)成單倍體植株或 經(jīng)過染色體加倍成 純二倍體植株。 ? 2，原生質(zhì)體的收集和純化 ? 飄浮法：常用的飄浮劑有 蔗糖 ? 沉淀法： 常用 甘露醇 作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，先將酶液洗出干凈，再用 Percoll飄浮一次。 核失活 － X射線，碘乙酰胺（ IOA）、碘乙酸 質(zhì)失活 －羅丹明（ R－ 6－ G，抑制線粒體氧化磷酸化。 轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用 基因的獲得、 載體系統(tǒng)、 基因轉(zhuǎn)化、 基因的表達(dá)與分析 、 細(xì)胞和組織培養(yǎng) 再生出植株 。 天然的野生型 Ti質(zhì)粒 （ Vir區(qū)）， 25bp的重復(fù)序列 ? 構(gòu)建根癌農(nóng)桿根瘤菌 大腸桿菌穿梭質(zhì)粒 ? 篩選標(biāo)記基因 啟動(dòng)子 信號(hào)序列； 人工多克隆位點(diǎn)； 縮短載體長(zhǎng)度 。 2 表達(dá)分析的方法