【正文】 并已開展了與經(jīng)典擬南芥生態(tài)型（ Col）的比較基因組研究及耐鹽、耐低溫表型比較分析等。而采集自我國西藏、新疆等地的擬南芥生態(tài)型則由于其生活環(huán)境的特殊，很可能具有一些特別重要的抗逆基因資源。 課題負(fù)責(zé)人： 陳受宜 承擔(dān)單位： 中科院遺傳與發(fā)育研究所，中國農(nóng)科 院生物技術(shù)所 主要學(xué)術(shù)骨干： 陳受宜，黃榮峰，周奕華 專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)比例： % 課題 重要耐鹽、耐低溫新基因的克隆與功能研究 充分利用擬南芥、水稻的耐鹽、耐低溫突變體 克隆 與 耐逆性狀（重要表型和關(guān)鍵代謝途徑）相關(guān)的 重要新功能 基因 ，并進(jìn)行其表達(dá)調(diào)控和 功能 調(diào)控機(jī)理的 研究 。培養(yǎng)博士后 6 人、博士及碩士研究生 20 人。 課題組人員已經(jīng)獲得了一系列重要的前期研究結(jié)果，包括： Ca2+/CaM 可能參與逆境信號途徑中轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)、鹽脅迫下 水稻類受體激酶 WAK 的轉(zhuǎn)錄增加、鹽脅迫誘導(dǎo)質(zhì)外體多肽類受體激酶 DUF26 轉(zhuǎn)譯增加、細(xì)胞骨架對離子通道有廣泛的調(diào)控作用、獲得了與耐鹽堿脅迫相關(guān)的擬南芥 PKS5 突變體、證明了細(xì)胞質(zhì)膜鉀和鈣離子通道受細(xì)胞骨架和蛋白激酶調(diào)控、證明了至少有 2 個 CDPKs 參與鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、發(fā)現(xiàn)了一個可能作為滲透脅迫感受器（ osmosensors）的包括 10 個成員的基因家族等等。 項(xiàng)目的創(chuàng)新性和特色： （ 1）從項(xiàng)目的整體思路上，提出了 植物應(yīng)答高鹽和低溫脅迫的 “信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、代謝調(diào)控 ”分子機(jī)制三個層次的 研究方案 。初步完成 2?3 種主要農(nóng)作物 耐鹽、耐低溫性狀改良的分子育種技術(shù)設(shè)計(jì)，并獲得 35 個耐鹽、耐低溫作物新品系等。 (2)、多基因遺傳轉(zhuǎn)化方案及轉(zhuǎn)基因作物生物學(xué)效應(yīng)研究：利用 Gateway 重組技術(shù)將多個（如 35 個）與耐鹽、耐低溫等抗逆性狀密切相關(guān)的基因同時與上述鑒定的組織特異及高鹽或低溫特異誘導(dǎo)的啟動子融合，轉(zhuǎn)化水稻或擬南芥。 作物響應(yīng)高鹽、低溫等脅迫的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理 ： 包括對逆境誘導(dǎo) 轉(zhuǎn)錄因子家族（如 WRKY、 NAC、 MYB、 bZIP 等家族）成員及其作用的啟動子調(diào)控元件的克隆和功能分析等。 重要耐逆資源植物 重要 耐鹽、耐低溫 性狀和關(guān)鍵代謝途徑相關(guān)的重要新基因的克隆 和功能分析 ： 課題擬開展的研究工作內(nèi)容主要包括：（ 1）利用野生稻和栽培稻雜交選育的滲入品系，從中篩選出一些具有明顯耐低溫、耐鹽的材料；利用 Affymetrix 最新的水稻全基因組芯片對這些滲入品系進(jìn)行表達(dá)譜分析，結(jié)合對親本和雜交后代的基因型分析、驗(yàn)證，鑒別出與耐低溫、耐鹽等抗逆表型密切相關(guān)的基因，并對其中的重要新基因進(jìn)行功能和表達(dá)調(diào)控分析；（ 2）根據(jù)小鹽芥與擬南芥基因表達(dá)譜的比較分析，克隆由鹽脅迫特異誘導(dǎo)的、可能與小鹽芥的特殊耐高鹽性狀密切相關(guān)的一些基因，如 ATHB7和 NAC 等編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因及表達(dá)受這些轉(zhuǎn)錄 因子調(diào)控的一些重要基因KIN KIN COR4 COR78（ RD29A）、 LTI65（ RD29B） 等 （見附圖）；（ 3）利用 小鹽芥和野生稻的 EMS 誘變或 TDNA 插入突變體庫篩選高度耐鹽或?qū)}脅迫高度敏感、耐低溫的突變體，并進(jìn)行基因克隆與基因功能分析；（ 4）利用生活在不同極端生態(tài)環(huán)境條件下（低溫、鹽堿、高海拔）的不同生態(tài)型擬南芥及其雜交后代篩選高度耐鹽或?qū)}脅迫高度敏感、耐低溫的株系并進(jìn)行基因的克隆與功能分析等；（ 4）、與課題 5 合作，通過基因表達(dá)譜比較分析，研究小鹽芥與擬南芥、不同生態(tài)型擬南芥之間應(yīng)答高 鹽、低溫脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。 項(xiàng)目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題包括： “ 類 受體激酶 鈣 細(xì)胞骨架”（ RCC）介導(dǎo)的 作物 響應(yīng)高鹽 /堿、低溫等環(huán)境脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 分子 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制； 作物應(yīng)答 高鹽 /堿、低溫等脅迫的 部分重要功能 基因 的轉(zhuǎn)錄 調(diào)控機(jī)理； 作物重要耐鹽、耐低溫等性狀新基因的克隆與功能分析及 抗逆基因 分子互作機(jī)制 ； 作物應(yīng)答高鹽、低溫與應(yīng)答水分脅迫之間通過滲透調(diào)節(jié)交匯點(diǎn)的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制； 重要 耐鹽、耐低溫基因的生物學(xué)整合效應(yīng)分析 （耐鹽、耐低溫相關(guān)基因的多基因表達(dá)合理操控方案研究）。 三、研究方案 整體思路： 根據(jù)項(xiàng)目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題和主要研究內(nèi)容（見第三、六部分），項(xiàng)目整體上分為植物應(yīng)答高鹽和低溫脅迫的 “信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、代謝調(diào)控 ”分子機(jī)制三個層次的實(shí)驗(yàn)研究（課題 4）；同時利用生物信息 學(xué)的理論與方法，結(jié)合國內(nèi)外研究進(jìn)展和本項(xiàng)目的研究結(jié)果，建立植物應(yīng)答高鹽、低溫 、高滲 脅迫的分子調(diào)控 “網(wǎng)絡(luò) ”機(jī)制模型（課題 5）；并在上述工作基礎(chǔ)上，通過 構(gòu)建 “智慧型 ”（ 適時、適地、適量 ） 基因表達(dá)啟動子和多基因表達(dá)載體， 應(yīng)用多基因 作物遺傳轉(zhuǎn)化 方法，對 重要耐鹽、耐低溫基因的生物學(xué)整合效應(yīng) 進(jìn)行 分析 （課題 6） 。 （ 2） 在研究方案中，特別注重 充分利用最新的生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)的理論與方法，綜合植物抗逆生物學(xué)和功能基因組學(xué)研究的海量數(shù)據(jù)，進(jìn)一步建立植物應(yīng)答高鹽、低溫脅迫的分子調(diào)控“網(wǎng)絡(luò)”機(jī)制模型，并隨時根據(jù)研究進(jìn)展不斷完善相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)模型。 課題研究內(nèi)容的創(chuàng)新性和預(yù)期的可能突破點(diǎn)：上述研究內(nèi)容中涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子在植物響應(yīng)高鹽、低溫脅迫過程中的作用和分子互作機(jī)理均屬未知，而我們尚未發(fā)表的前期研究結(jié)果已初步證明它們在植物的逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有重要作用 ，因此具有明顯的創(chuàng)新性。本課題主要研究 內(nèi)容可概括為轉(zhuǎn)錄因子上游調(diào)控因子、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄下游調(diào)控機(jī)制三個層次（見以下示意圖），具體內(nèi)容 包括： （ 1） ERFs 類轉(zhuǎn)錄因子的上、下游基因的克隆及其編碼蛋白的生化分析和其啟動子區(qū)域調(diào)控元件的研究，分析此類轉(zhuǎn)錄因子在乙烯及 ABA 信號途徑中的分子調(diào)控作用機(jī)制； （ 2）依賴 ABA的 轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的上游調(diào)節(jié)因子的 鑒定及功能分析，研究其調(diào)控相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的機(jī)制及 參與 ABA 和非生物脅迫 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控 機(jī)制 ； （ 3） 分析與植物響應(yīng)高鹽、低溫脅迫密切相關(guān)的一些重要 轉(zhuǎn)錄因子（如 WRKYWRKY7 bZIP bMyb bHLH、 Dof2）及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合蛋白（如 TTG1等）的功能與作用機(jī)制， 克隆與逆境應(yīng)答相關(guān)的新的轉(zhuǎn)錄 調(diào)控 因子并對其 功能和作用進(jìn)行分析；（ 4）與課題 1 合作，分析研究 WRKY、 bZIP、bMyb 和 bHLH 等家族部分成員活性 受磷酸化調(diào)控的分子機(jī)制，鑒定并研究 35 個重要的轉(zhuǎn)錄因子蛋白激酶； （ 5）與課題 4 合作， 鑒定所克隆的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的 、與逆境應(yīng)答相關(guān)的 靶基因 ，分析這些 基因 的 產(chǎn)物 所參與或 調(diào)節(jié)的抗逆代謝過程 （如細(xì)胞壁成分、色素等次生代謝途徑及小分子滲透物質(zhì)、無機(jī)離子等的積累與分配）。申請發(fā)明專利 8?10 項(xiàng)；發(fā)表 SCI 論文 25 篇 （ 其中影響因子 大于 5 的論文 8篇 以上） 。其中，山東生態(tài)型小鹽芥（ 2 個）主要表現(xiàn)耐鹽性狀；新疆生態(tài)型小鹽芥主要表現(xiàn)耐干旱性狀；加拿大生態(tài)型小鹽芥主要表現(xiàn)耐低溫和干旱的性狀。 課題擬開展的研究工作內(nèi)容主要包括：（ 1） 利用野生稻和栽培稻雜交選育的滲入品系，從中篩選出一些具有明顯 耐低溫、耐鹽的 材料；利用 Affymetrix最新的水稻全基因組芯片對這些 滲入品系 進(jìn)行表達(dá)譜分析，結(jié)合對親本和雜交后代的基因型分析、驗(yàn)證，鑒別出 與耐低溫、耐鹽等 抗逆表型密切相關(guān)的基因 ，并對其中的重 要新基因進(jìn)行功能和表達(dá)調(diào)控分析； （ 2）根據(jù)小鹽芥與擬南芥基因表達(dá)譜的比較分析，克隆由鹽脅迫特異誘導(dǎo)的、可能與小鹽芥的特殊耐高鹽性狀密切相關(guān)的一些基因，如 ATHB7 和 NAC 等編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因及表達(dá)受這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的一些重要基因 KIN KIN COR4 COR78（ RD29A）、 LTI65（ RD29B） 等 （見附圖）；（ 3）利用 小鹽芥 和野生稻的 EMS誘變 或 TDNA 插入突變體庫 篩選高度耐鹽或?qū)}脅迫高度敏感 、耐低溫 的突變體，并進(jìn)行基因克隆與基因功能分析；（ 4）利用生活在不同極端生態(tài)環(huán)境條件下 （低溫、鹽堿 、高海拔） 的不同生態(tài)型擬南芥 及其雜交后代 篩選高度耐鹽或?qū)}脅迫高度敏感 、耐低溫 的 株系 并進(jìn)行基因 的 克隆與功能分析 等；（ 4）、與課題 5 合作，通過基因表達(dá)譜比較分析，研究小鹽芥與擬南芥、不同生態(tài)型擬南芥之間應(yīng)答高鹽、低溫脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。培養(yǎng)博士后 2 人、博士及碩士研究生 10 人。對以上兩種方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行生物學(xué)效應(yīng)（耐鹽或耐低溫性狀）分析，并進(jìn)一步在水稻、玉米、棉花或番茄等作物中進(jìn)行驗(yàn)證，探討作物抗逆性與基因協(xié)同效應(yīng)的關(guān)系。開始水稻 耐低溫材料的篩選；篩選 TDNA插入及 EMS誘變的PKS5突變體，對其進(jìn)行表型分析；通過real time PCR等方法不同亞型 CaM在逆境脅迫下的表達(dá)變化； PKS5突變體的篩選、鑒定和表型分析； PKS5各突變蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建。 完成基因芯片的實(shí)驗(yàn)室管理系統(tǒng)（ LIMS）的搭建；初步整理約 1000 張擬南芥基因芯片數(shù)據(jù) ，包括不同生長時期和不同條件處理；收集約 30 個野生擬南芥居群的種子，并建立相關(guān)的種質(zhì)信息；繪制耐冷水稻的基因組表達(dá)譜，鑒定出與水稻低溫脅迫相關(guān)的候選基因。具體包括： 用 RNAi, antisense和 dominate negative及過表達(dá)等方法 , 研究胞外多肽及受體激酶在逆境脅迫下的表型變化，并做相應(yīng)的分子水平鑒定； 分析新發(fā)現(xiàn)的微絲及微管結(jié)合蛋白的結(jié)合及調(diào)控微絲或微管骨架的特性， 通過轉(zhuǎn)基因植物研究骨架結(jié)合蛋白的生物學(xué)功能；分析這些蛋白在逆境下的表達(dá)及分布特性，以及它們在逆境條件下對細(xì)胞骨架的調(diào)控作用；開展鹽處理下，野生型和 PLD突變體中磷脂酶 D、蛋白激酶、磷酸酶的表達(dá)與活性變化，及其與耐鹽性的關(guān)系。 繼續(xù)鹽芥 TDNA 插入突變體庫的構(gòu)建； EMS 突變體的篩選、遺傳與生理分析； Knockdown 突變體載體大規(guī)模轉(zhuǎn)化鹽芥；泌鹽基因結(jié)構(gòu)與功能分析；鹽芥的氧化還原蛋白質(zhì)組分析。 分離 ABA 和 Ca2+誘導(dǎo)型啟動子 2 個；分離根組織和葉片組織特異啟動子 3 個；鑒定 ABA 和 Ca2+誘導(dǎo)型高活性啟動子 2個。對 1 萬個以上的水稻突變體材料進(jìn)行篩選；構(gòu)建作圖群體，完成耐鹽和低溫遺傳分析和 QTL 作圖。 開始較大規(guī)模地利 用新功能基因轉(zhuǎn)化玉米、小麥、油菜等作物，并逐步開始對新功能基因的整合生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行分析。研究鹽和低溫處理下，植物細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)的變化；細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白與各種逆境信號之間的關(guān)系；通過遺傳學(xué)及生理生化分析對所克隆的基因的功能進(jìn)行研究，尋找有利于提高作物耐鹽性的基因，嘗試轉(zhuǎn)化水稻等農(nóng)作物。 完成鹽芥 TDNA 插入突變體庫的構(gòu)建； EMS 突變體的篩選、遺傳與生理分析；大規(guī)模鹽芥的轉(zhuǎn)化與插入位點(diǎn)的分析；泌鹽基因克隆與表達(dá)分析。 分離關(guān)鍵調(diào)控元件 35 個；分離 DNA結(jié)合蛋白 23 個；初步闡明多個抗性基因轉(zhuǎn)化植株的協(xié)同效應(yīng)。 在植物應(yīng)答高鹽、低溫分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型的基礎(chǔ)上，通過算法調(diào)整、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)挖掘等手段，詳細(xì)分析其中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的作用。 爭取在基礎(chǔ)理論方面獲得 23 項(xiàng)較重要突