【正文】 大量研究表明，影響 QTL 初級(jí)定位精確度和靈敏度的最重要因素是群體的大小。不過(guò)，這種方法特別的費(fèi)工費(fèi)時(shí)，而且只能用在效應(yīng)比較大的 QTL 的精細(xì)定位。 使用代換系重疊群對(duì) QTL進(jìn)行精細(xì)定位之前，必須多年多點(diǎn)對(duì)代換系進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，以確定目標(biāo)代換系的代換片段上帶有控制目標(biāo)性狀的 QTL。邢永忠（邢永忠等， 20xx）從重組自交系中選擇出遺傳背景高度一致的自交系配組，建立近等基因系，使位于第 7 染色體上的同一區(qū)間內(nèi)控制水稻抽穗期和株高的主效 QTL 同時(shí)以單個(gè)的孟德?tīng)栠z傳因子表現(xiàn)。隨后利用SNP 標(biāo)記對(duì) 4000 株 BC5F1 群體進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該 QTL 位于 DGAT 基因的 3’端，而 3’端的唯一差異只是苯丙氨酸的插入。就是 將材料與 輪回親本連續(xù)回交， 通常 需回交 6 代以上。選擇與目標(biāo)性狀 緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，選育近等基因系。近等基因系與受體親本的差別主要在目標(biāo) QTL 所在的染色體區(qū)域，所以，它們之間的任何表型性狀的差異都來(lái)源于這個(gè)供體片段。 利用近等基因系對(duì) QTL 克隆 Yano（ Yano et ）利用含有 1505 個(gè)單株的近等基因系群體對(duì)水稻的光敏感 QTLHd1進(jìn)行了圖位克?。?Mapbased cloning），將 Hd1 定位在 12 KB 的范圍內(nèi)。在回交過(guò)程中，選擇基因組與輪回親本的基因逐步趨近，且 具有供體目標(biāo)基因的后代株系，兩者的相似程度隨回交世代數(shù)的增加而增加，而在輪回親本的近等基因系中，非目的基因的供體親本的染色體片段和位點(diǎn)逐代減少，這樣的回交后代株系和輪回親本組成了一對(duì)近等基因系。 作物 QTL 功 能及其克隆策略研究進(jìn)展 基因組學(xué)時(shí)代的首要任務(wù)是制作圖譜和測(cè)定序列，后基因組學(xué)時(shí)代則是對(duì)基因組功能進(jìn)行注釋 (Genome annotation)，這同樣是功能基因組學(xué)的首要研究目標(biāo)。所以，很難用這一方法對(duì)大多數(shù)基因進(jìn)行克隆。使用轉(zhuǎn)座子插入到某一個(gè)功能基因的內(nèi)部或者鄰近區(qū)域時(shí)，就會(huì)使該基因失活，并誘導(dǎo)產(chǎn)生出突變型。大量的 EST克隆以及 EST 資料庫(kù)的建立，為使用生物信息學(xué)的方法克隆基因提供了前提條件?；ㄉ兆钪饕纳砘钚怨δ苁亲杂苫宄芰涂寡趸芰?，花色苷的抗氧化能力是 VE的 50倍， VC的 20倍，西南大學(xué)碩士學(xué)位論文 10 而且其對(duì)人體的生物有效性是 100%，服用后 20分鐘就能在血液中檢測(cè)到（唐忠厚，周麗 20xx）。 黑玉米是玉米栽培中的一個(gè)變種，因籽粒中色素成分含量高而成黑色（紫色）?；ㄉ盏纳锎x途徑是目前研究的最為廣泛和深入的植物 次生代謝途徑（ Bartel and Matsuda 20xx） 。 Williamsburg 20xx； Martens et al. 20xx）。 in1基因在隱性純合狀態(tài)下會(huì)增強(qiáng)籽粒糊粉層花色苷積累，在顯性純合狀態(tài)下則會(huì)抑制糊粉層花色苷的積累， anl1基因是從玉米籽粒糊粉層花色苷缺失的材料中鑒定的一個(gè)隱性致死基因。從分離的這些基因的染色體分布來(lái)看， 9個(gè)結(jié)構(gòu)基因分別分布于 9等染色體上， 12個(gè)調(diào)節(jié)基因則分布 于 9等染色體（ 第 2 章 引言 13 第 2 章 引言 本研究的意義和目的 玉米籽粒中色素的成分和含量與玉米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)密切相關(guān)。 在 二十 世 紀(jì)初，植物學(xué)家對(duì)玉米紅色和藍(lán)色籽粒的分離現(xiàn)象就很重視，他們通過(guò)大量雜交試驗(yàn)，研究了玉米的色澤變異與基因位點(diǎn)（ Emerson R ； Hayes H K. 1917； Anderson 1924； Anderson 1927； Emerson 1932；Rhoades 1936）。袁文娟等（ 袁文娟 20xx）利用黑玉米自交系。 Sourdille等（ Sourdille 1996） 對(duì)含 392單株的 F2群體的葉緣、主莖、穎片和花絲等顏色基因的 QTL定位，共檢測(cè)到 8個(gè)位點(diǎn)，分別位于第 第 第 第 第 第 第 10染色體，其中第 2和第 10染色體上的 QTL對(duì)表型的貢獻(xiàn)率最大。普通黃玉米主要是類胡蘿卜素，而黑玉米主要是花色苷。Chandler 1999）通過(guò) Mu轉(zhuǎn)座元件誘變，分離到一個(gè)新的影響籽粒糊粉層顏色的調(diào)節(jié)基因 pac1（ pale aleurone color1），該基因表現(xiàn)為隱性非致死，并且僅在籽粒中表達(dá)。 Cornish 1995； 西南大學(xué)碩士學(xué)位論文 12 Sharma et al. 20xx； 李義龍等 20xx； 劉海峰 20xx； Sharma et al. 20xx）。例如矮牽?；ㄍǔＧ闆r下不產(chǎn)生天竺葵色素，玉米和金第 1 章 文獻(xiàn)綜述 11 魚(yú)草不能產(chǎn)生飛燕草色素?；ㄉ帐怯绍赵c葡萄糖以糖苷鍵形式結(jié)合形成的 一類廣泛存在于植物 體內(nèi) 的類黃酮多酚化合物（ 趙昶靈，郭華春 20xx；張建霞等， 20xx） ，是構(gòu)成植物花瓣、葉片、果實(shí)、種子等器官顏色的最主要水溶性色素（ Klein et al. 1989； Tanaka et al. 20xx；Park et al. 20xx）。 Hou等發(fā)現(xiàn)花色苷可以阻塞有活性的分裂素蛋白至活酶路徑，從而有效抑制腫瘤的發(fā)生 （ Hou et al. 20xx）。 作物 QTL 克隆及其功能研究進(jìn)展 目前，擬南芥、水稻、番茄、玉米、馬鈴薯、甜菜、小麥、大麥、胡椒等作物都已經(jīng)有克隆 QTL 的報(bào)道，其中，利用圖位克隆法克隆得到的 QTL 主要來(lái)自番茄、擬南芥和水稻等模式植物。常用的轉(zhuǎn)座子有金魚(yú)草的 Tam3 和玉米的 Ac/Ds、 En/Smp。圖位克?。?Mapbased cloning）又被稱為定位克?。?Positional cloning），此方法是先把目標(biāo)基因精確定位于分子標(biāo)記連鎖圖上，利用與目的基因緊密 連鎖的標(biāo)記篩選大片段 DNA 文庫(kù) (如 BAC、 YAC、或 Cosmid 文庫(kù) )，并構(gòu)建含有目標(biāo)基因區(qū)域的精細(xì)物理圖譜，然后采用染色體步行 (Chromosome walking) 的方法逐步逼近目的基因，最后，用含目標(biāo)基因的大片段克隆做亞克隆分析， 或作為探針篩選 cDNA文庫(kù)，通過(guò)功能驗(yàn)證確定基因。 作物 QTL 克隆策略 首先，功能克隆法就是根據(jù)性狀的基本生化特征，鑒定已知基因的功能后進(jìn)而分離目標(biāo)基因的一種 方法。國(guó)外利用某些攜有抗病害、蟲(chóng)害不同抗性基因的近等基因系作為一致遺傳背景的抗性鑒別品種，鑒定和檢測(cè)小種（生物型）及新的抗性基因， 或直接用作為育種計(jì)劃的供體（ Paterson 1993 ）。 Takahashi（ Takahashi et a1． 20xx）利用近等基因系對(duì)控制水稻光周期敏感的 QTLHd6 進(jìn)行了圖位克隆，將 Hd6 界定在 KB的區(qū)域內(nèi)， Hd6 編碼 蛋白激酶 CK2 的一個(gè)亞單位。因此，利用近等基因系發(fā)展而來(lái)的分 離群體是非常適合進(jìn)行 QTL 精細(xì)定位、 QTL 互作、品種改良等的良好材料。 第四， 雜交高世代 分離 群體材料中分離選育。 該方法是培育近等基因系中最常用的方法，如農(nóng)作物抗病 、抗逆性 近等基因系的構(gòu)建。 作物 QTL 近等基因系的構(gòu)建及其利用價(jià)值 近等基因系的定義 近等基因系 （ nearisogenic lines， NIL） 是 指 一 個(gè) 遺傳背景相同， 除了某一兩個(gè)基因外，其他基因都相同的兩個(gè)遺傳材料 ，是經(jīng)過(guò)一系列 、長(zhǎng)期的 回交過(guò)程 所產(chǎn)生的株系 （ Young et al，1988） 。 Li 等（ Li et al. 20xx）使用康乃爾大學(xué)選育的熱帶粳稻品種 Jefferson 作為輪回親本，和普通野生水稻材料 IRGC105491 配置組合，利用回交群體，把控制粒重的基因 精細(xì)定位于第 3 號(hào)染色體的標(biāo)記 JL123h 和 JL109 之間，區(qū)間大小為 KB。 作物 QTL 精細(xì)定位研究進(jìn)展 近年來(lái)，在 QTL 的精細(xì)定位方面已經(jīng)有大量的報(bào)道。為了尋找到分子標(biāo)記，往往需要做大量的篩選。因此，無(wú)論怎樣改進(jìn)統(tǒng)計(jì)分析的方法，也無(wú)法使得初級(jí)定位的精度或分辨率達(dá)到很高，估計(jì)出來(lái)的QTL 的置信區(qū)間一般都在 10cM 以上（ Zeng 1994； Alpert and Tanksley 1996），也不能確定檢測(cè)到的 QTL 中到底是只包含一個(gè)效應(yīng)比較大的基因，還是包含數(shù)個(gè)效應(yīng)比較小 的基因（ Yano and Sasaki 1997）。 SSSLs 通過(guò)多代回交，獲得只存在供體親本的一個(gè)代換片段的差異，基因組其它部分與受體親本完全相同。（根據(jù)與初級(jí)定位群體的關(guān)系，次級(jí)群體可以分為兩類，一類是由初級(jí)定位群體衍生而來(lái)，比如近等基因系（ Near Isogenic Lines， NILs）， QTL 等基因系（ QTL Isogenic Rebinants， QIRs）；另一類是與初級(jí)定位沒(méi)有關(guān)系的代換系群體，如單片段代換系 (Single Segment Substitution Lines, SSSLs)，染色體片段代換系 (Chromosome Segment Substitute Lines， CSSLs)，不同的次級(jí)群體的構(gòu)建過(guò)程和特點(diǎn)各不相同 (蔣洪蔚等，20xx)。就目前來(lái)說(shuō)，對(duì) QTL 的精細(xì)定位主要可以從以下三個(gè)方向著手： 第一，統(tǒng)計(jì)方法的合理利用和新的統(tǒng)計(jì)方法的開(kāi)發(fā)可以挖掘更多潛在的信息。該片段上共有 49 個(gè)轉(zhuǎn)座子， 29 個(gè) 還原 轉(zhuǎn) 座 子 ， 8 個(gè) 假設(shè) 蛋 白 ， 31 個(gè) 基 因。分析定位的區(qū)間附近的基因組序列，對(duì)該段區(qū)域上的基因進(jìn)行注釋。 學(xué)位論文作者簽名： 導(dǎo)師簽名： 簽字日期： 年 月 日 簽字日期： 年 月 日 目錄 i 目 錄 摘 要 ................................................................................................................................. I Abstract ............................................................................................................................. III 第 1 章 文獻(xiàn)綜述 ................................................................................................................ 1 QTL 精 細(xì)定位策略及研究進(jìn)展 ................................................................................ 1 QTL 精細(xì)定位 ............................................................................................... 1 QTL 精細(xì)定位策略 ....................................................................................... 2 作物 QTL 近等基因系的構(gòu)建及其利用價(jià)值 .............................................................. 4 近等基因系的定義 ......................................................................................... 4 用于 QTL 近等基因系的構(gòu)建方法 .................................................................. 5 近等基因系的利用價(jià)值 .................................................................................. 5 作物 QTL 功能及其克隆策略研究進(jìn)展 ..................................................................... 7 作物 QTL 克隆策略 ....................................................................................... 8 作物 QTL 克隆及其功能研究進(jìn)展 .................................................................. 9 玉米花色苷的研究進(jìn)展 ........................................................................................... 9 花色苷的生理功能 ......................................................................................... 9 花色苷的結(jié)構(gòu)和代謝途徑 ............................