動(dòng)植物細(xì)胞器離心法分離(完整版)
【正文】 轉(zhuǎn)速 )，球心顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的黏度。 ? 細(xì)胞器標(biāo)記酶的測定是評(píng)價(jià)細(xì)胞器內(nèi)膜組分和別離純度的主要依據(jù)，如線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠 B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被復(fù)原成無色。 (2) mol／ L蔗糖 + mol／ L Tris一鹽酸緩沖液 ()，配法同上。 2．器具： ? 解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃勻漿器，尼龍織物，刻度離心管，顯微鏡，冷凍高速離心機(jī)。 別離細(xì)胞核： 鼠肝勻漿 700 g離心 10 min 沉淀 (細(xì)胞核及質(zhì)膜碎片 ) 上清液 (1) 洗滌 ( mol／ L預(yù)冷蔗糖溶液 5 mL洗滌 2次，每次 1000 g離心 15 min。 玉米線粒體的別離 ? 從植物細(xì)胞別離線粒體，除了作線粒體功能測定外，在植物細(xì)胞遺傳工程中，常用于別離核外基因 —線粒體 DNA等目的。 50mmol/L的 TrisHcl緩沖液 ()配法： 三羥甲基氨基甲烷 (Tris)溶液與 42mL 后，加水稀釋至 100mL。待芽長到1~2cm長時(shí)剪下約 15g，放 0~4℃ 1h。 6．線粒體的觀察：取線粒體沉淀涂在清潔的載玻片上，不待干立即滴加 1％詹納斯綠 B染色 20min，放上蓋玻片，用顯微鏡觀察，線粒體是藍(lán)綠色圓形顆粒。利用低速離心機(jī)可以別離葉綠體，其別離在等滲溶液 (0． 35 mol／ L氯化鈉或 0． 4 mol／ L蔗糖溶液 )中進(jìn)行，目的是為了防止?jié)B透壓的改變引起葉綠體的損傷。本實(shí)驗(yàn)利用熒光顯微鏡對(duì)發(fā)熒光的葉綠體進(jìn)行觀察。 3．用 6層紗布過濾，濾液盛于燒杯中。 第二十四頁，共二十六頁。待芽長到 1~2cm長時(shí)剪下約 15g，放 0~4℃ 1h 第二十六頁，共二十六頁。 第二十五頁，共二十六頁。 5．將上清液在 3000 r／ min下離心 5 min．棄去上清液，沉淀即為葉綠體 (混有局部細(xì)胞核 )。 【 材料 】 菠萊葉片。在室溫下進(jìn)行別離要迅速。 【本卷須知】 實(shí)驗(yàn)全過程要求在 0℃ ~4℃ 進(jìn)行，如果使用非冷凍控溫的離心機(jī)，一般只宜別離細(xì)胞核和線粒體，同時(shí)注意使樣品保持冷凍；盡可能充分破碎組織、縮短勻漿時(shí)間。 3．用多層紗布過濾，濾液經(jīng) 700 g離
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