【正文】 ul 1) 94 oC 預變性 5 min 2) 94 oC變性 30 sec 3) 55 oC退火 30 sec 4) 72 oC延伸 45 sec 5) 重復步驟 2)4)30次 6) 72 oC延伸 10 min ? 瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR結(jié)果 1) 稱取 ， 再加入 1ml 50 TAE緩沖液 ， 49ml 高水 ，置微波爐或水浴加熱至完全融化 ， 取出搖勻 ， 則為 1％ 瓊脂糖凝膠液 。 具體實驗步驟 ?Ⅰ .植物基因組 DNA的制備 ?Ⅱ .TOC33基因片段的 PCR擴增 ?Ⅲ . DNA的瓊脂糖凝膠上回收與純化 ?IV. DNA片段的體外重組與轉(zhuǎn)化 ?V. 克隆的篩選與鑒定 ? Ⅰ. 植物基因組 DNA的制備 ? 取 EP管中 ， 放在液氮中冷凍處理后 ， 在 EP管中充分搗碎 ， 加入 抽提緩沖液 ， 65℃ 水浴處理 10min。 ? 12,000rpm離心 3min， 取上清 ， 加入二倍體積預冷的無水乙醇沉淀 ， 遇有絮狀沉淀 ， 4,000rpm離心 5min。 2) 取電泳槽里面的膠板 ， 用膠帶將兩端封好 ， 調(diào)平 ， 并放好樣品梳子 。 ? 電泳染色后，在紫外分析儀上切取所需要的條帶，按 1克膠： 1000添加提取緩沖液，放在 60度的金屬浴中溶解。 ? 2. 42OC熱激 90sec。第二天從轉(zhuǎn)化的平板上挑去白色的菌落以驗證是否是陽性克隆 ?V. 克隆的篩選與鑒定 1. 用移液槍在 LB培養(yǎng)基 500ul， 再用滅過菌的牙簽在生長藍白斑的平板上挑取陽性克隆放于 EP管中 ， 丟棄牙簽 ， 蓋緊管口 ， 用報紙包好放到 37OC， 200r/min的搖床中過夜培養(yǎng)； 2. EP管出現(xiàn)混濁 ， 用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒 。在雜交箱中利用特定探針雜交。 ? 利用 6 HIS、 GST（谷胱甘肽）等和親和樹脂純化：通過表達目標基因的融合蛋白，利用親和層析洗脫出目標蛋白 ? 自動核酸 /蛋白純化工作站 目標蛋白功能分析 ? 抗體的制備：多抗、單抗 ? DNA蛋白質(zhì)相互作用研究： Gelshift實驗、蛋白質(zhì)磷酸化分析、酵母單雜交系統(tǒng)等 ? 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)相互作用研究：酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體表面展示技術(shù)等 蛋白體內(nèi)表達研究 ? Western blotting：利用抗原 抗體反應(yīng)，對蛋白質(zhì)混合物中的目標蛋白進行鑒別和定量 ? 免疫組織化學研究：通過切片技術(shù)和免疫反應(yīng)，利用特異抗體檢測特定蛋白在組織細胞內(nèi)的表達和定位 ? 蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng) 基因轉(zhuǎn)化實驗和轉(zhuǎn)基因結(jié)果分析 ? 轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建：載體、農(nóng)桿菌、特殊抗生素 ? 植株的轉(zhuǎn)化：葉盤轉(zhuǎn)化法、基因槍 ? 植株的篩選：熒光檢測、 GUS染色、 PCR法 ? 基因功能分析：激光共聚焦顯微鏡、 FISH等 連接反應(yīng) ⑴ 在滅菌的 。 （ 2）將該 EP管放入預加溫至 42℃ 的水浴中，放置 90s，快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻 1~2 min。 將步驟 5中上清轉(zhuǎn)移到套放于 UNIQ10柱中 ， 8,000rpm室溫離心 15秒 。不能劇烈混合，否則會出現(xiàn)基因組 DNA污染。迅速冷卻 4℃ 。 EcoR V ← Tcloning site cDNA 文庫應(yīng)用分離新基因的方法 ? 發(fā)現(xiàn)并分離 克隆 新基因始終是分子生物學研究的主要任務(wù)和目的，雖然 cDNA 文庫的用途很多，但是，應(yīng)用于分離新基因是其最重要的用途。 RACE )。RACE 均可 )。而用 PCR 法從 cDNA 文庫中快速克隆基因的方法，只需提取 λ 噬菌體 DNA，按保守序列設(shè)計 PCR 引物便可將未知片段進行克隆。該方法適合于表達豐度高的基因的篩選分離。 反式 PCR 反式 PCR 克隆 cDNA 全長的基因原理是：雙鏈 cDNA 合成后進行尾 — 尾連接，環(huán)化的 cDNA 用位于已知序列內(nèi)的限制性內(nèi)切酶酶切位點造成缺口或用 NaOH 處理使之變性，然后用 2條基因特異性引物對重新線性化或變性的 cDNA 進行擴增。同一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，又是存在著不同的拼接方式，通過篩庫的辦法同時將不同拼接方式的 克隆 篩選出來可能性較小，而使用 PCR 擴增后，有利于觀察到不同的拼接方式。早在 1988年， FROHMAN 等即用此方法成功地獲得了 4種 mRNA 的 539。 RACE )或加至第一鏈 cDNA 339。分離方法主要有兩種：第一，對于非全長 cDNA 文庫，即不管是經(jīng)典的 cDNA 文庫方法或差減法構(gòu)建的 cDNA 文庫，需要利用已經(jīng)獲得的新 cDNA 序列片段，通過 RACE 方法獲得新基因的全長序列。 成像分析 在 1% 的瓊脂糖凝膠上點樣電泳 ~1h， 電泳結(jié)束后 EB 染色 15～20min， 凝膠成像分析結(jié)果 。：（ 1）如果要提高質(zhì)粒的濃度，可以用30?l Elution Buffer， 37℃ 或 50℃ 下放置 2分鐘， 10,000rpm室溫離心 1分鐘。 重復步驟 7。 （ 4）將 200μL上述培養(yǎng)物加到含 100μg/mL氨卞青霉素的 LB平板上（平板表面涂有 20mg/mL的 Xgal 40μL和 20mg/mL的 IPTG 40μL），以玻璃涂布棒輕輕地將轉(zhuǎn)化細胞平鋪于瓊脂平板表面。 注意事項： 目的基因和 c2x質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物的加入比例應(yīng)根據(jù)電泳