【正文】 ............................... 13 1 作物枯萎病原菌的遺傳分化 ........................................................................................... 13 2 作物枯萎病的生物防治研究 ........................................................................................... 17 ................................................................................................ 17 生長(zhǎng)的影響 .............................................................................. 22 .................................................................... 25 ....................................................................... 28 刀菌生防因子芽孢桿菌的復(fù)篩 ........................................................................... 31 .............................................................................................................. 32 ..................................................................................... 33 技術(shù) ..................................................................................... 34 生防菌 JK2對(duì)西瓜枯萎病的防治效果 ........................................................................ 38 （三）生物農(nóng)藥菌種資源庫(kù)建設(shè) .............................................................................................. 42 （四）人才培養(yǎng) ....................................................................................................................... 43 （五）發(fā)表論文及出版專著 ..................................................................................................... 43 （六）專利 .............................................................................................................................. 44 （七）農(nóng)藥登記證及企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定 ........................................................................................... 44 四、課題目前與用戶或有關(guān)企業(yè)相互聯(lián)系、信息交流和合作情況 .................................................... 45 五、課題支撐條件落實(shí)情況 ............................................................................................................ 45 六、課題組織實(shí)施及其管理工作的經(jīng)驗(yàn) ........................................................................................... 46 生物農(nóng)藥研究中心科研管理規(guī)定 .............................................................................................. 46 “生物農(nóng)藥研究中心 ”科管監(jiān)事會(huì)章程 ....................................................................................... 52 2 七、目前存在的問(wèn)題及建議 ............................................................................................................ 55 八、簽章 ........................................................................................................................................ 55 附表 1 ............................................................................................................................................ 56 附表 2 ............................................................................................................................................ 58 3 編 報(bào) 要 求 一、格式要求 ； 級(jí)與課題規(guī)定的密級(jí)相同； A4幅面紙，文字內(nèi)容一律由計(jì)算機(jī)打印填報(bào)； ，再出現(xiàn)時(shí)可以使用縮寫(xiě)。 二、 課題總體進(jìn)展 （概述課題實(shí)施進(jìn)展，課題已取得的階段性成果及前景評(píng)價(jià)，包括人才、專利、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)戰(zhàn)略在課題中的實(shí)現(xiàn)情況，產(chǎn)品研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展等） 1青枯病生物殺菌劑 ANTI8098A的研制與應(yīng)用 研究從青枯菌生物防治方法入手， 尋找對(duì)青枯病菌有強(qiáng)烈抑制作用的芽孢桿菌，篩選出青枯病生防菌 ANTI8098，對(duì)青枯病原菌有良好的抑制作用，經(jīng)德國(guó)菌種保存中心（ DMSZ）鑒定為蠟狀芽孢桿菌，定名為 ANTI8098A。 2枯萎病生物殺菌劑 “枯特利 ”研究 進(jìn)行了蔬菜（瓜類(lèi)、豆類(lèi)、茄科作物類(lèi)等）枯 萎病的調(diào)查與病原菌的分離培養(yǎng)，測(cè)定了豇豆 、花生 、甜椒、辣椒、西瓜、甜瓜、黃瓜等農(nóng)作物上 分離了尖孢鐮刀菌的 ITS 基因序列，并成功地登錄 GENEBANK，獲得基因序列號(hào) 9 個(gè)。 引進(jìn)美國(guó) MIDI 公司的 Sherlock 微生物鑒定儀建立了基于脂肪酸差異的菌種快速鑒定系統(tǒng)，對(duì)本項(xiàng)目涉及菌株進(jìn)行了分類(lèi)地位鑒定，同時(shí)也承接了大量外單位的菌種鑒定工作。分離的菌株用剪葉法回接番茄組培苗， 各菌株回接 30株苗，設(shè)清水對(duì)照，將回接的組培苗置于 30℃ 人工氣候箱下， 7d后觀察回接發(fā)病率。脂肪酸型的模型建立也為其他植物病原菌的致病性研究提供了思路和方法。 Schell, 2020），而抑制其它一些基因的表達(dá)，例如運(yùn)動(dòng)性基因（ Liu et al., 2020），多聚半乳糖醛酸酶產(chǎn)物，含鐵細(xì)胞產(chǎn)物（ Huang et al., 1993。引物設(shè)計(jì) ， 根據(jù)青枯雷爾氏菌的 phcA基因片段全長(zhǎng)利用Primer5軟件設(shè)計(jì) 4對(duì)擴(kuò)增引物 ， 由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成 ， 引物序列如下 ： 引物 1：phcA3： 5’CGACAACGAGTGGGGCTACTCGAAC3’； phcA4： 5’GGAAGG CGTTGAGGTTGT3’； 8 引物 2： phcA5： 5’TGCCTTTCCACCTTCTGT3’； phcA6： 5’AGGCG TTGAGGTTGTAGGC3’。細(xì)菌色譜研究表明，青枯雷爾氏菌在細(xì)菌色譜上有 2個(gè)峰，無(wú)致病力菌株是前峰高于后峰，而強(qiáng)致病力菌株后峰高于前峰，該方法可用于青枯雷爾氏菌細(xì)胞的識(shí)別（ 9）。比較轉(zhuǎn)化 GFP前后的青枯雷爾氏菌無(wú)致病力菌株生物學(xué)特性，結(jié)果表明，其對(duì)通氣量要求無(wú)差異（圖 16），對(duì)初始 pH要求無(wú)差異 （圖 17），對(duì)溫度的適應(yīng)無(wú)差異（圖 18），生長(zhǎng)速度無(wú)差異（圖 19）。 建立了青枯雷爾氏菌分化的細(xì)菌色譜鑒定體系 。 13 （二） 作物枯萎病 原菌 的遺傳分化及其生物防治研究 1 作物枯萎病 原菌 的遺傳分化 枯萎病是由致病性鐮刀菌引起的一種土傳真菌病害，該病在福建省內(nèi)發(fā)病嚴(yán)重，在瓜類(lèi)作物（西瓜、黃瓜、甜瓜等）、香蕉、花生等 作物上均有發(fā)生，導(dǎo)致減產(chǎn) 20%～ 30%，嚴(yán)重的的田塊可達(dá) 50%～80%，甚至絕產(chǎn)。 PCR 反應(yīng)的每個(gè)樣的總體積為 25μL。為反映 RAMS標(biāo)記的多態(tài)性，統(tǒng)計(jì)各引物的多態(tài)條帶百分率。 3） 菌株的遺傳距離和組群劃分與菌株 致病性也存在一定的相關(guān)性，如黃瓜分離的 1 株非致病力尖鐮孢菌被獨(dú)立劃分為 1 個(gè)組群。從培養(yǎng) 7 d 的平板上打取 3 個(gè) 6 mm 的菌片，置于盛有 100 mL PSA 液體培養(yǎng)基的 250 mL 三角 瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 25℃ ，搖床轉(zhuǎn)速為 110 轉(zhuǎn) /分，每天取 3 瓶，過(guò)濾去除菌絲，收集發(fā)酵液。兩個(gè)菌株發(fā)酵過(guò)程中 OD 值的變化趨勢(shì)非常類(lèi)似，都隨著發(fā)酵進(jìn)程， OD 值逐漸增高，在發(fā)酵中期出現(xiàn)一個(gè)峰值，在峰值過(guò)后，其變化趨于平緩。尖孢鐮刀菌在偏酸性的條件下生長(zhǎng)較好，生長(zhǎng)過(guò)程使得環(huán)境 pH 逐漸升高，導(dǎo)致生長(zhǎng)條件惡化，生長(zhǎng)減緩，在偏堿性的條件下尖 孢鐮刀菌生長(zhǎng)受到抑制；這也是生產(chǎn)上應(yīng)用石灰防治枯萎病的原理之一。歐氏距離計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表 8，聚類(lèi)過(guò)程見(jiàn)表 9，聚類(lèi)結(jié)果見(jiàn)圖 13?？傮w而言，不同寄主的尖孢鐮刀菌在培養(yǎng)過(guò)程顏色不同，同一尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)過(guò)程發(fā)酵液顏色會(huì)發(fā)生階段性變化。第 2 階段為對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)時(shí)間為 35d，菌株的 OD 值、 pH 值、菌絲干重變化最大，菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段。 02468101248 96 120培養(yǎng)時(shí)間 ( h )菌落直徑(cm)不加蔗糖加蔗糖 010203040506070809048 96 120培養(yǎng)時(shí)間( h )增長(zhǎng)率(%) 圖 18 甜瓜尖孢鐮刀菌（ 132）菌落生長(zhǎng) 圖 19 甜瓜尖孢鐮刀菌（ 132）菌落增長(zhǎng)率 辣椒尖孢鐮刀菌 （ 147）培養(yǎng) 48h、 96h、 120h，在加蔗糖培養(yǎng)基菌落生長(zhǎng)直徑分別為為 、 、 ，分別比同期對(duì)照組增加 %、 %、 %（圖 圖 21）。 蔗糖濃度對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的影響結(jié)果表明，尖孢鐮刀菌在加蔗糖和不加蔗糖培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)差異極顯著，加蔗糖組尖孢鐮刀菌比未加蔗糖的對(duì)照組生長(zhǎng)速度快。王拱 辰等 (1995) 選用硝酸鉀、磷酸二氫鉀，再加維生素 B 和 C 組成 VBC 培養(yǎng)基，結(jié)果證明能促進(jìn)多數(shù)尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢。在培養(yǎng)基設(shè)計(jì)上， Bilai39。 (B)淀粉型 KH2PO41g； KNO31g； ； ；淀粉 ；蒸餾水 1L。菌株 119 于 PSA 平板上培養(yǎng) 7d 后，刮下菌絲于 100mL 無(wú)菌水中，充分振勻，用雙層紗布過(guò)濾兩遍制成孢子懸液備用； 配制 上述不同成分的培養(yǎng)基（ AF）， 用 250mL 的三角瓶每瓶盛 50mL 培養(yǎng)液，高壓滅菌，待培養(yǎng)基冷卻后，各加入 1mL 已備好的鐮刀菌孢子懸浮液，另留瓶作空白對(duì)照。 (A)全糖型 培養(yǎng)基 (B)淀粉型 培養(yǎng)基 (C)低糖型 培養(yǎng)基 (D)尿素型 培養(yǎng)基 (E)低氮型 培養(yǎng)基 (F)VBC 型 培養(yǎng)基 圖 24 不同培養(yǎng)基條件下培養(yǎng) 5d 的尖孢鐮刀菌 119 菌株菌落形態(tài) 表 12 不同培養(yǎng)基和不同尖孢鐮刀菌的培養(yǎng) 5d 菌落直徑均值和標(biāo)準(zhǔn)差 培養(yǎng)基類(lèi)型 均值 標(biāo)準(zhǔn)差 (A)全糖型 (B)淀粉型 (C)低糖型 (D)尿素型 (E)低氮型 (F)VBC 型 27 尖孢鐮刀菌菌株 119 120 123 130 142 表 11 不同培養(yǎng)基和不同尖孢鐮刀菌的培養(yǎng) 5d 菌落直徑方差分析表 變異來(lái)源 平方和 自由度 均 方 F 值 顯著水平 處理 1 間 （培養(yǎng)基） 5 處理 2 間 （菌株間） 4 誤差 20 總