基因工程重組人干擾素(完整版)
【正文】 Na2HP04 、 50mmol/L EfEPE (pH ) 的緩沖液 , 進(jìn)行沉淀。 α的表達(dá)家蠶作為一種用于表達(dá)外源基因的宿主有易于養(yǎng)殖、生產(chǎn)周期短、夕陽(yáng)基因表達(dá)量高的優(yōu)點(diǎn) , 同時(shí)由于家蠶為真核生物 , 能對(duì)表達(dá)產(chǎn)物自行進(jìn)行糖基化修飾 , 產(chǎn)生有生物活性的蛋白 , 并且在產(chǎn)物提取的過(guò)程中只要將家蠶進(jìn)行勻漿 , 再進(jìn)行抽提即可 , 操作上十分方便 , 因此 , 它在基因工程領(lǐng)域內(nèi)被廣泛應(yīng)用。 |對(duì)于擾素基因的取用 , 不僅可以使用構(gòu)建基因文庫(kù)的方法 , 對(duì)已了解其氨基酸或核昔酸割成的干擾素也可以用化學(xué)合成的方法先合成其編碼的 DNA 序列 , 再對(duì)其進(jìn)行表達(dá)。IFNγ不僅抑制TH2細(xì)胞產(chǎn)生IL4，而且抑制IL4對(duì)B細(xì)胞的作用，特別是抑制B細(xì)胞生成IgE。 趨化作用216。 提高單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的抗原提呈能力216。在抗原致敏之前使用大劑量干擾素或?qū)⒏蓴_素與抗原同時(shí)投入會(huì)產(chǎn)生明顯的免疫抑制作用；而低劑量干擾素或在抗原致敏之后加入干擾素則能產(chǎn)生免疫增強(qiáng)的效果。 端和 539。而人 IFNt1 的 121~136 位對(duì)抗病毒活性作用較大 , 人 IFN 子的 N 端 10 個(gè)集 | 基酸也是保持其活性所必需的。氣 mnlAd EDTA 終止反應(yīng)。具體操作步驟如下 : 將含有人 IFNp 基因的重組質(zhì)粒 pBV92 用 EcoR I 及 Hind E 酶切 , 分別作為探針模板及插入片段 , 同時(shí)用 PvuII 切載體 pSVZdhfr 質(zhì)粒 , 使其線性化后將外源基因插入。用含人 IFN γ編碼區(qū)基因的探針與噬菌體γ MG9 構(gòu)建的鼠 M600 基因組 DNA 文庫(kù)在 20% 甲酷膠中進(jìn)行低嚴(yán)格性的雜交 , 膜用 、 擰棱酸納及 %NaEbS04 在室溫洗滌兩次。為構(gòu)建嵌合干擾素 , 可先將親代干擾素的編碼序列在相同位點(diǎn) S1(Sa113A I ) 、 Pv(PVUE) 、 S2(Sa113A I ) 切斷 , 產(chǎn)生含有氨基端 1~60 、 1~92 、 61~92 、 93~150 、 93~166 、 151~166 位氨基酸的片段 , 用 6% 的聚丙烯釀膠凝膠電泳分離 ( 圖 124) 。酵母是一種較為常用的表達(dá)宿主 , 但其外源基因的大量表達(dá)必須在缺少元機(jī)磷的條件下才能進(jìn)行。將 Sepharose4B 與純化的抗 IFN α單克隆抗體混合振搖 , 室溫放置 4h 后低速離心 , 并用 () 的緩沖液洗去未結(jié)合的抗體 , 加入等體、積的乙醇膠并振蕩 4h 以上 , 將殘存的活性基團(tuán)加以封閉 O : 用 pH 的醋酸鹽緩沖液及 pH 的 TrisHCl 緩沖液交 i替洗滌 3 次 , 并用 pH 的 加以平衡 1 后裝柱。 24h 后 9000r/ min 離心 2min, 并將沉淀分散于 500 μ L 冷的含 20mmoiAEfEP ES 、 5mmol/L MgCl2 、 I20mmol 只 L KCl 、 7mm014 二硫蘇糖醇、 10% 甘氨酸、 05%NP40() 的裂解液中 , 冰浴 2min 后 9OOOr/min 離心 8IIlino 取上清與 50 μ L poly(rI):poly(rC) 瓊脂在 30 ℃共浴 15min, 離心去除未吸附部分 , 而將結(jié)合物與 [ α 32p]ATP 及磷酸激酶在 30 ℃水浴 20h 。新型雜合的 IFN α D 對(duì) NK 細(xì)胞的調(diào)節(jié)能力比親本提高了 10~400 倍 , 如將 IFN α 4 與 IFNtl 進(jìn)行嵌合 , 得到的 IFN 活性分別是親代的 4 倍及 20 倍。2. 提高免疫系統(tǒng)機(jī)能在小鼠實(shí)驗(yàn)中重組 IFN γ對(duì) NK 細(xì)胞的活性、吞噬細(xì)胞的溶解性、絲裂原誘導(dǎo)的母細(xì)胞化均有促進(jìn)作用 , 同時(shí)減少外周血及骨髓量。在 [ γ ,32p]ATP 存在的情況下 , 干擾素被 32p 標(biāo)記且不影響其活性。相信在不久的將來(lái) , 基因工程方法生產(chǎn)的干擾素會(huì)在疾病的診斷及治療方面發(fā)揮更大的作用 , 同時(shí)也成為生命科學(xué)研究中的一種有效的工具。狗的 IFN γ與細(xì)胞因子和細(xì)胞嵌合后可以被抗干擾素的單克隆抗體所識(shí)別 , 并且有如下應(yīng)用 : ①水泡性口炎病毒噬菌斑抑制實(shí)驗(yàn) 。3. 抗腫瘤通過(guò)與糖基化的淋巴細(xì)胞毒素嵌合 ,IFN γ可以提高小鼠對(duì) HT1080 纖維肉瘤、 G,361 惡性黑色素瘤、 ZR751 乳腺瘤等腫瘤的抗性。此外 , 如上面介紹的將 IFN 與 TNF 結(jié)合 , 可以產(chǎn)生不同的活性。2. 抗增生活性在含 15% 小牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 5 104 個(gè) /ml Dauda 細(xì)胞 ,48h 后加入 IFN, 再培養(yǎng) 72h, 用 2BI 型庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)
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