【正文】 dorff 管中。配制液體MRS培養(yǎng)基200mL，滅菌后倒10個平板，待其冷卻凝固后于恒溫箱過夜，用移液槍取100μl菌種于平板，用玻璃涂棒將菌種涂均勻，作好標記，每個濃度的細菌液接兩個平板，于37℃恒溫箱培養(yǎng)48h[6]。然而，近年來越來越多抗生素抗藥性乳酸菌被發(fā)現具有一定可轉移的抗藥性，為乳酸菌的安全敲響了警鐘。第二種是在質粒載體上將PCR 產物克隆，然后進行測序。由于其種類少，普遍性存在，分子大小適中，總量一般占細菌rRNA總量的80 %左右，在結構與功能上具有高度的保守性和特異性，基因序列一般包含約50個功能域，基因序列的變化緩慢，所以將16S rRNA 用作分子指標, 這樣能實現微量、快速、準確、簡便的對乳酸菌進行分類鑒定。是繼青霉素后第二個生產并用于臨床的抗生素。并且國內外生物學家都認為人類身體的健康程度和生命的長短都與腸道中的乳酸菌有著非常密切的關系。目前已知天然抗生素不下萬種。 streptomycin。有機白蘿卜表皮附生乳酸菌鏈霉素抗性分析畢業(yè)論文 目 錄摘 要 1Abstract 11 前言 1 抗生素的定義 1 抗生素的用途簡介 1 蘿卜表皮附生乳酸菌 1 鏈霉素 1 16S rRNA分析技術在乳酸菌分類學的應用 1 本論文研究的目的及意義 12 材料和方法 1 材料和儀器 1 樣品 1 試劑 1 儀器 1 培養(yǎng)基及配制 1 實驗方法 1 乳酸菌的培養(yǎng) 1 乳酸菌的分離純化 1 乳酸菌總DNA的提取 1 16S rRNA目的基因的PCR擴增及克隆分析 1 最小抑制濃度（MIC）的測定 13 結果 1 乳酸菌的分離 1 基因組DNA的提取 1 16S rRNA的PCR擴增片斷電泳結果分析 1 重組子的篩選和鑒定 1 16S rRNA分析 1 鏈霉素抗性分析結果 14 結論 1總結與體會 1致謝詞 1參考文獻 1摘 要以市售的有機白蘿卜為研究對象，分析其表皮附生的乳酸菌對鏈霉素的抗藥性。 resistance1 前言白蘿卜是根菜類的主要蔬菜，屬十字花科、蘿卜屬的一年或二年生草本雙子葉植物[1]。 抗生素的用途簡介抗生素以前被稱為抗菌素，事實上它不僅能殺滅細菌而且對霉菌、支原體、衣原體、螺旋體、立克次氏體等其它致病微生物也有良好的抑制和殺滅作用，通常將抗菌素改稱為抗生素。乳酸菌的發(fā)酵原理是：乳酸菌進行無氧呼吸，葡萄糖即經過糖酵解生成丙酮酸，丙酮酸再脫氫產生乳酸。它的抗結核桿菌的特效作用，開創(chuàng)了結核病治療的新紀元。16S rRNA中的S是沉降系數，反映生物大分子在離心場中向下沉降速度的一個指標。通過將結果與16S rRNA 數據庫中的序列進行比較的方法，找出它在進化樹中的位置，這樣就可以鑒定出蘿卜表面乳酸菌中存在的乳酸菌種類,。該研究以期待為有白機蘿卜鮮食的食品安全評價提供參考。 乳酸菌的分離純化在MRS固體培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，將菌種稀釋至合適的濃度，均勻涂布于加入碳酸鈣后的固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培育48h。然后加入擴增后的DNA片段4 μl，再加入pGMT載體 1 μl ，再加入3 μl ddH2O，T4 DNA ligase 1 μl輕輕混勻后（注：以上添加溶液順序不能顛倒）在PCR儀中16℃過夜連接。(2) ，加入到Eppendorf管中，使用普通離心機，12000 rpm離心1分鐘，盡量去除上清液。(8) 向吸附柱CB3中加入500 μl漂洗液PW，12000 rpm（13400g）離心3060秒，倒掉收集管中的廢液。當分離菌株的最小抑菌質量濃度(Minimal Iinhibitory Concentration, MIC)≤ Xμg/mL時為敏感性菌株，反之當MICXμg/mL為抗藥性菌株。在當前研究中，從平板中分離得到43個溶鈣圈菌落，編號為為LS1到LS43。由電泳亮斑可知，細菌基因組DNA的大小超過12 kb，因此，則可認為達到了對基因組DNA的提取要求。由檢測圖10可知，連接反應已將PCR擴增后的16S rRNA基因連接到了T載體上， DH5α中得到了表達，形成白色菌落。畢業(yè)設計不僅是對大學前三年所學知識的檢測，也是對自己的思維和實驗能力的一種鍛煉，并使之有所提高。在近兩個月的實驗中，老師既是良師又是益友，我自始自終得到了向老師的指導和幫助。他們嚴謹的學風和謙和的為人使我受益非淺；他們還在百忙之中，花費了不少寶貴的時間來為我修改論文，使之盡可能完善和嚴謹，正是在向老師熱心的幫助和指導下，我順利的完成了畢業(yè)論文。在實驗過程中遇到了很多困難，一開始不知道怎么下手，通過指導老師和師兄的幫助，我漸漸進入了畢業(yè)設計的正軌。Stackebrandt[9]等認為當細菌的16S rRNA序列的相似性大于或等于97%時，則可以認為是同一個屬，當序列相似性大于或等于98%時，可以認為是同一個種。 圖5 DNA Marker III 圖6 16S rRNA的PCR擴增電泳圖（部分） 由圖6電泳亮斑可知，對所有樣本菌的16S rRNA基因皆進行了PCR擴增。研究和應用DNA的基礎是提取純化結構完整的DNA，實驗中將SDS法和CTAB法結合用于DNA的提取，不僅能使微生物細胞能更完全的得到破碎，并有利于蛋白質等雜質與DNA的分離。培養(yǎng)液制備：在2mL MRS液體培養(yǎng)基中接種從平板上挑取的單菌落，然后在30℃環(huán)境中靜止培養(yǎng)過夜，然后用生理鹽水稀釋至每毫升1107 個細胞的濃度，即得到培養(yǎng)液。(10) 將吸附柱CB3放置于一個干凈的Eppendorf管中，向吸附膜的中央部分滴加50 ~ 100 μl洗脫緩沖液EB，室溫放置1分鐘，12000 rpm（13400g）離心2分鐘將質粒溶液收集到Eppendorf管中。(4) 向Eppendorf管中加入250 μl溶液P2，溫和的上下翻轉46次使菌體充分裂解。 重組菌落的篩選向含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)皿中加入40 μl Xgal和30 μl IPTG后涂布平板，37℃放置1~3 h，加入100 μl重組大腸桿菌液涂在LB平板上。將分離的單菌落編號菌種在MRS固體培養(yǎng)基上，保藏溫度4℃，備用。 試劑 DNA提取與檢測試劑表1 DNA提取與檢測試劑試劑生產廠家ddH2O北京奧博星生物技術有限責任公司TE Buffer北京奧博星生物技術有限責任公司10%（W/V）SDS北京奧博星生物技術有限責任公司20 mg/mL蛋白酶K北京奧博星生物技術有限責任公司5M NaCl北京奧博星生物技術有限責任公司CTAB/ NaCl溶液（）成都市科龍化工試劑廠24∶1氯仿/異戊醇成都市科龍化工試劑廠25∶24∶1 苯酚/氯仿/異戊醇成都市科龍化工試劑廠異丙醇成都市科龍化工試劑廠無水乙醇、70%乙醇成都市科龍化工試劑廠電泳級瓊脂糖成都市科龍化工試劑廠核酸染色劑成都市科龍化工試劑廠DNA Marker I, DNA Marker VII成都市科龍化工試劑廠 PCR擴增試劑表2 PCR擴增試劑PCR擴增試劑生產廠家4種底物：dNTP (dATP+dCTP+dGTP+dTTP)Tiangen公司10Taq 緩沖液Tiangen公司Taq DNA polymerase ( )Tiangen公司MgCl2（25mM）Tiangen公司PCR mixture東盛公司 16S rRNA目的基因的PCR擴增表3 16S