從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌實驗方案說明(完整版)
【正文】 碘液、95%乙醇。在土壤稀釋過程中，用相同的移液槍頭由濃到稀來稀釋。再繼續(xù)分區(qū)劃線23次，以獲得較純的菌種。革蘭氏染色步驟：涂片、干燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。于涂片上滴人3～5滴5%孔雀綠水溶液。然后進行一系列的鏡檢——革蘭氏染色、芽孢染色（具體步驟同上）觀察是否符合附表中芽孢桿菌的指標(biāo)溫度對菌種培養(yǎng)的影響；淀粉水解試驗；溫度對菌種的影響；明膠液化試驗；糖發(fā)酵試驗；乙酰甲基甲醇試驗()；吲哚試驗；耐鹽性試驗；檸檬酸鹽利用試驗。淀粉水解實驗以1824h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個平板可分區(qū)劃“+“字接種，）或直接移種于淀粉肉湯中，于36177。 觀察結(jié)果，若培養(yǎng)基變藍(lán)色，則表明該菌能利用檸檬酸鹽作為碳源而生長，即為陽性反應(yīng)，以“＋”表示。調(diào)整D使（Rr）/。調(diào)pH時要小心操作，避免回調(diào)。革蘭氏染色時注意脫色的時間的控制，過長或過短都會影響實驗結(jié)果。菌種保藏法（斜面冰箱包保藏法） 將菌種接種在新鮮外面培養(yǎng)基上，定溫培養(yǎng)長出豐滿菌苔后（一般形成芽孢的細(xì)菌要形成芽孢），貼上標(biāo)簽，放在試管上，在棉塞部位用尼龍紙或防水紙包好，以防外界污染和水浸濕，放入4℃冰箱中保藏。產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶活性的測定發(fā)酵：將初篩純菌種接種于30/250mL 種子培養(yǎng)基,37 ℃、250r/min搖床培養(yǎng)過夜。接種培養(yǎng) 以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應(yīng)試管中，空白對照管不接種，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應(yīng)，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“＋”表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用“－”。用接種針將各種桿菌分別接種于兩種發(fā)酵管內(nèi)，每種發(fā)酵管重復(fù)兩次，標(biāo)記，要與斜面菌種標(biāo)記相對應(yīng)。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。溫度對微生物生長的影響
將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基熔化倒平板。芽孢呈綠色，菌體紅色。用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時，開始計算時間約4～5min。脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約15－20秒，后立即用流水沖洗。獲得產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌純種：上述劃線接種后的菌落中各挑取形態(tài)特征不一致的點接于倒好的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基中，一個土樣取8個平板兩兩標(biāo)記同一位置同序號標(biāo)記，一平板分5個區(qū)域，點接重復(fù)兩次，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。每個濃度做3個平板（重復(fù)）。 香柏油、二甲苯吲哚試驗：乙醚、吲哚試劑：40％NaOH溶液、α奈酚，淀粉酶活力測定：1%3, 5 二硝基水楊酸試劑 儀器或其它用具無菌玻璃涂棒 無菌吸管 接種環(huán) 無菌培養(yǎng)皿 土樣 三角瓶 燒杯 洗瓶 玻棒 試管 酒精燈 擦鏡紙 接種環(huán) 酒精燈 載玻片 吸水紙等。四、實驗材料和用具 土樣采集：采集廣大植物園內(nèi)的有機土壤，和生化樓下花壇的有機土壤 營養(yǎng)瓊脂(%)：蛋白胨1 ～ 蒸餾水 將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸
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