[醫(yī)藥衛(wèi)生]基因擴增技術pcr(完整版)
【正文】 的其他序列無明顯同源性； ? 兩個引物的 Tm值要盡可能接近。 Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實性 、 引物的退火 、 模板與 PCR產物的解鏈溫度 、 產物的特異性以及引物二聚體的形成等等 。 該酶的應用濃度一般為 1~?L反應體系 ， 然而 ， 酶的用量可依據(jù)不同的模板分子或引物而變化 。 ? RNA 特異性的檢測 ， 注意假基因的干擾 。 縮短合成時間（適用于非特異大片段） RTPCR實驗的策略 模板中 G+C比例過高 可加 110%二甲基亞砜 （ DMSO） ， 使模板易于解鏈和引物特異性的結合 。 重復實驗：為防止因各種原因引起的實驗 誤差，應進行反復驗證，以確 保實驗結果的重演性。 熒光定量 PCR技術的整個操作過程在完全封閉的狀態(tài)下進 行，有效的避免了 “ 假陽性 ” 的實驗結果。 由于一個 PCR產物可以與多分子的染料結合，因此其靈敏度很高。 實時定量 PCR檢測前列腺基質細胞中 GAPDH 和 TGFb1 表達的熒光曲線圖 (SYBR Green I 摻入法 ) 實時定量 PCR檢測前列腺基質細胞中 GAPDH 和 TGFb1 表達的 熔解曲線圖 （單一峰表明產物是單一的，無非特異擴增 ） 實時定量 PCR檢測前列腺基質細胞中 TGFb1的表達 Well Gene Ct ?Ct ??Ct 2??Ct control GAPDH 0 1 TGFb1 plasmid GAPDH TGFb1 plasmid+siRNA GAPDH control TGFb1 TGFb1 plasmid TGFb1 TGFb1 plasmid+siRNA TGFb1 ?Ct=目的基因的 Ct值 內參照基因的 Ct值 ? ? Ct=實驗組樣品的 ?Ct對照組樣品的 ?Ct 01234567control TGFb1 plasmid TGFb1 plasmid+siRNA實時定量 PCR檢測前列腺基質細胞中 TGFb1表達的柱形圖 TaqMan探針檢測 PSA質粒 （ 107拷貝至 103拷貝）的熒光曲線圖 TaqMan探針檢測 PSA質粒的 Ct值得出的標準曲線 y=0,23x+11,06。 2022年 9月，美國西北大學（ Northwestern University）醫(yī)學院 泌尿實驗室主任 Chung Lee（李鐘）教授應邀來實驗室參觀講學。因此，只限于分析特異性擴增產物；（可用溶解曲線分析產物的特異性）染料可影響擴增效率。 PCR擴增后不需進行電泳等后處理 ， 而直接定量樣品模板 數(shù) ， 使其具有分析時間短 ， 重復性好 、 省力 、 低費用等優(yōu) 點。 紫外照射可促使 DNA形成二聚體 ， 阻止鏈的延伸 。 對很難擴增的片段可考慮用下游引物反轉錄。 常用持家基因表達的穩(wěn)定性 常用持家基因在基因組序列中存在假基因情況 不同類型細胞中持家基因表達的穩(wěn)定性 Vandesompele, J., K. De Preter, et al. Genome Biol, 2022 不同類型組織中持家基因表達的穩(wěn)定性 de Kok, J. B., R. W. Roelofs, et al. Lab Invest,2022 在前列腺癌組織中一些持家基因表達的穩(wěn)定性 Fig. Selection of the most suitable reference genes for normalization in prostate cancer samples using geNorm
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