【正文】 1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。 雙抗原夾心法測抗體反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。但在HBsAg的檢測中應(yīng)注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。例如在某種條件下，抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。在標(biāo)記免疫測定中，一般加入過量的標(biāo)記試劑以保證與待測物徹底反應(yīng)?！∶庖邷y定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測定的應(yīng)用范圍極廣，在臨床檢驗(yàn)中可用于測定： 1) 體液中的各種蛋白質(zhì)，包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等。假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。如果抗原或抗體極度過剩，則無沉淀物形成，在免疫測定中稱為帶現(xiàn)象（zone phenomenon）。Ab的解離程度與K值有關(guān)。經(jīng)過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個區(qū)段，其中兩個相同的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段（Fab）。Ig的輕鏈?zhǔn)窍嗤?，有κ（kappa）和λ（Lambda）兩種型別。 加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。 板 育 。影響ELISA試驗(yàn)效果常見問題原因分析及解決辦法ELISA試驗(yàn)以靈敏度較高、特異性較好的特點(diǎn)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，但操作中的各個環(huán)節(jié)對試驗(yàn)的檢測效果影響較大，如不注意，有可能導(dǎo)致顯色不全、花板等結(jié)果。 。 ，使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗徹底； ，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗徹底。 ,孔與孔之間液體交叉。 色 1. 顯色劑配制后放置時間過長或使用過期顯色劑； 2. 加顯色劑時濺出孔外造成液體回流。 讀五類Ig的重鏈結(jié)構(gòu)不同，這決定了它們的抗原性也不同。每個Fab都保存結(jié)合抗原的能力，但只有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)，是單價的，與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀。IgM抗體一般為保護(hù)性抗體具有免疫性。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。抗體過量稱為前帶（prezone），抗原地過量稱為后帶（postzone）。例如：絨毛膜促性腺激素（hCG）和黃體生成激素（LH）均由α和β兩個亞單位組成，其結(jié)構(gòu)的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的。2) 激素，包括小分子量的甾體激素等。以標(biāo)記抗體（Ab※）檢測抗原（Ag）為例，反應(yīng)式如下：Ag+ Ab※ → AgAb※+ Ab※在反應(yīng)產(chǎn)物中有與Ag結(jié)合的Ab※和游離和Ab※，如不將兩者分離而測定標(biāo)記物，測得的結(jié)果將為兩者之和。均相EIA在臨床檢驗(yàn)中較少應(yīng)用。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類型：　雙抗體夾心法測抗原　　雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：1） 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，作一步檢測。雙抗體夾心法測抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。4）加底物顯色本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。如抗原中會有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。繼而加酶標(biāo)記針對抗原的特異性抗體。生物素為小分子化合物，分子量244。由于ABSELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗(yàn)中ABSELISA應(yīng)用不多?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可剪割，價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。小珠的另一特點(diǎn)是更易于使洗滌徹底，使用特殊的洗滌器，使小珠在洗滌過程中滾動淋洗，其洗滌效果遠(yuǎn)較板孔的浸泡式為好。 　包被的方式將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。此間接結(jié)合在固相上的抗原遠(yuǎn)離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。重組抗原的另一特點(diǎn)是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應(yīng)。應(yīng)用單抗包被時應(yīng)注意，一種單抗僅針對一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。封閉的手續(xù)與包被相類似。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的（）。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。值得注意的是，在選用酶制劑時，除其純度RZ外，更應(yīng)注意酶的活力。最好用親和層析純的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用此法。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。例如某一HRP：抗人IgG制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經(jīng)1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗(yàn)時，將發(fā)生陽性反應(yīng)。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉），以防止細(xì)菌生長。,5,539。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。另一種HRP的底物為3(4羥基)苯丙酸[3(4hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計(jì)測量。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。陽性對照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量最好在試劑說明書中標(biāo)明。 標(biāo)本的采取和保存可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。 試劑的準(zhǔn)備按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。吸干應(yīng)徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；，洗滌34次（或按說明規(guī)定）。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行，時間一般不需要嚴(yán)格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間，及時判斷。這類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長時間（1224小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。(~），重復(fù)測定數(shù)次，177。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的位置。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。陰性對照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物（）。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測而得到的。應(yīng)注意的是，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。更應(yīng)注意的是，N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復(fù)鈣人血漿，陽性對照中抗HBc含量為125177。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，繪制時常用半對數(shù)紙，以檢測物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區(qū)域。全面質(zhì)量管理的宗旨在于預(yù)防差錯的產(chǎn)生?！　?）確定控制的對象；　　2）規(guī)定控制對象的標(biāo)準(zhǔn)（預(yù)期值）；　　3）制定或選擇控制方法和手段；　　3）測量實(shí)際數(shù)據(jù)；　　4）比較或較對實(shí)際數(shù)據(jù)與預(yù)期值之間的差異，并說明產(chǎn)生這一差異的原因?？刂葡奘峭ㄟ^統(tǒng)計(jì)計(jì)算出來的，在后我們將詳細(xì)介紹（）。如果以測定值為橫坐標(biāo)，以出現(xiàn)的頻率為縱坐標(biāo)作圖，就可繪出一個呈鐘形的曲線圖。2SD范圍內(nèi)分布的數(shù)據(jù)占總體的95%，在X177。準(zhǔn)確度不能以數(shù)字表示，往往用不準(zhǔn)確度來衡量。 臨床決定性水平（clinical decision leuel）當(dāng)某個被測物的濃度達(dá)到某一水平時，臨床醫(yī)師必須采用醫(yī)療措施。不宜反復(fù)冰融或自行分裝。 質(zhì)控血清的制備每個實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自己的條件，選用臨床中心提供的質(zhì)控血清，或按以下方法自己制備本室使用的質(zhì)控血清（以乙肝質(zhì)控血清為例）。不可反復(fù)凍融。1） 最佳條件下的測定誤差?，F(xiàn)舉例說明HBsAg ELISA法檢測時OCV的測定。做常規(guī)檢驗(yàn)的技術(shù)人員，在常規(guī)檢驗(yàn)的條件下，將質(zhì)控血清放在常規(guī)檢測樣本中，進(jìn)行20次檢驗(yàn)，結(jié)果計(jì)算同OCV法。,未知值質(zhì)控血清變異(routine conditions varianclunknown value 簡稱RCVU)的測定有時為了避免主觀性,再作RCVU測定。每批測定放一份質(zhì)控血清時，一次超過2SD應(yīng)作為告警，二次超出2SD為失控。有些實(shí)驗(yàn)室不是每天進(jìn)行ELISA項(xiàng)目的檢驗(yàn)，而ELSIA試劑盒效期短，用一批號試劑盒連續(xù)常規(guī)測20次，難度較大。即刻性質(zhì)控統(tǒng)計(jì)方法，適于ELISA測定的質(zhì)控。 發(fā)質(zhì)控物進(jìn)行調(diào)查這是國內(nèi)外室間質(zhì)評的常用形式。部臨檢中心經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，將評價結(jié)果寄回各實(shí)驗(yàn)室。將前20次的數(shù)值求出的和SD作質(zhì)控框架圖，第21次的數(shù)值，依次點(diǎn)入即可。即刻法的建立具體計(jì)算方法如下：1)先將測定值從小到大排列2)計(jì)算X和SD。更換試劑盒或更換質(zhì)控血清，找出原因糾正后重新檢驗(yàn)。在此不再舉例說明。若太大應(yīng)該查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在該實(shí)驗(yàn)室中選擇素質(zhì)最好、操作最熟練的技術(shù)員進(jìn)行認(rèn)真地專門測定，選用最佳的試劑盒，檢測之前，將恒箱、加樣器等認(rèn)真校正、調(diào)校正、調(diào)試，使用新的加樣吸頭等，即在最佳、最理想的條件下進(jìn)行檢測。3） 未知值的血清在常規(guī)檢驗(yàn)條件下的誤差。如果該試驗(yàn)還有其它要　　求，則應(yīng)加所要求濃度的質(zhì)控物。2） 56℃加熱10小時來活。自制的不定值質(zhì)控血清，在一批質(zhì)控血清將用完之前，需準(zhǔn)備下一批質(zhì)控血清。質(zhì)控血清是已有靶值的血清，在每次的常規(guī)檢驗(yàn)中加入一份或數(shù)份，通過所得結(jié)果來了解本次檢驗(yàn)的情況?！　〗^對偏差=檢驗(yàn)的均值真值（或靶值）　　相對偏差=絕對偏差真值247。當(dāng)我們要求檢驗(yàn)結(jié)果在X177。正態(tài)曲線以下的面積稱概率，常用樣本的均數(shù)（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）來表示，其計(jì)算方法如下：　　　　均值、標(biāo)準(zhǔn)差和概率的關(guān)系如下：　　X177。系統(tǒng)誤差是指一系列測定結(jié)果與真值或靶值存在有同一傾向的誤差，有明顯的規(guī)律性，可在一定條件下重復(fù)出現(xiàn)，是可以通過質(zhì)控預(yù)防和校正的?！　?）采取行動，解決差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)的實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控是全面質(zhì)量管理中的一個重要環(huán)節(jié)。測定小分子量物質(zhì)常用競爭法（），其標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負(fù)相關(guān)。每次試驗(yàn)設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照。因此，這類試劑盒規(guī)，如N（或其他數(shù)值），否則將出現(xiàn)假陽性結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿，陽性對照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9177。目視法簡捷明了，但頗具主觀性。在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。酶標(biāo)儀的可測范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。 比色比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行，顯色反應(yīng)結(jié)束時加入終止液終止反應(yīng)。洗滌時設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。 洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測量較正。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。大部分ELISA檢測均以血清為標(biāo)本。陽性對照品中含量約為10ng/ml。 　酶反應(yīng)終止液常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。