【正文】 M651 手術(shù)顯微鏡 德國 Leica 公司 VMSLDF2 激光多普勒測量儀 英國 Moor 公司 AL104 電子天平 梅特勒 托利多儀器上海有限公司 VEX130 超聲波細(xì)胞破碎儀 美國 SONICS 公司 80℃ 超低溫冰箱 美國 Thermo Scientific Forma 公 司 PH 計 美國 Thermo Scientific Forma 公司 Microfuge 22R 臺式微量冷凍離心機(jī) 美國 Beckman Coulter 公司 超純水制取器 美國 Millipore 公司 垂直板凝膠電泳系統(tǒng) 美國 BioRad 公司 10 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 Biotek synergy2 多功能酶標(biāo)儀 美國 BioTek 公司 垂直板凝膠電泳系統(tǒng) 美國 BioRad 公司 EG1160 石蠟切片機(jī) 德國 Leica 公司 37℃ 隔水式恒 溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司 60℃ 電熱恒溫水箱 上海一恒科技有限公司 DM 2500 正置熒光顯微鏡 德國 Leica 公司 Nikon Eclipse A1 激光共聚焦顯微鏡 日本 Nikon 公司 4. CD1 小鼠短暫性局灶性腦缺血 /再灌注模型的建立 按線栓法 [16]建立 tMCAO 模型（如圖 4 所示）。術(shù)后測血流，以缺血 側(cè)血流下降 90%以上為模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。 工作液： Reagent A+Reagent B (50:1)。加入相應(yīng)的二抗（羊抗兔， 1:2022；羊抗鼠， 1:2022），室溫 2 小時。腦片按照二甲苯、逐級降低的梯度酒精中（ 100%、 95%、 90%、 80%、 70%）脫蠟，用作免疫熒光染色， PBS漂洗 5分鐘，吸干，免疫組化筆圈出各 個樣品， %TritonX100（每個樣品 2040μl） 破膜 5分鐘， PBS漂洗 5分鐘， M 檸檬酸鈉抗原修復(fù)，先高火 5分鐘，將載玻片放入再低火 5分鐘，之后自然冷卻， PBS 漂洗（ 5分鐘 Χ3遍）， 10%BSA封閉 1小時（濕盒中），一抗 4℃ 過夜（分別為 NeuN， 1:200； Beclin1， 1:500）， PBS漂洗（ 5分鐘 Χ3遍），二抗（ 488標(biāo)記羊抗兔， 1:500； cy3標(biāo)記 羊抗鼠， 1:500）， 37℃ 隔水式恒溫培養(yǎng)箱 1小時（避光）， PBS漂洗（ 5分鐘 Χ3遍）， DAPI （ 1:1000） 染色 5分鐘， PBS漂洗（ 5分鐘 Χ3遍）。 0分：小鼠正常運動，無神經(jīng)缺損癥狀； 1分：提尾時右 前肢內(nèi)收 ，不能完全伸直； 2分：行走向偏癱傾倒； 3分：向偏癱旋轉(zhuǎn)； 4分：不能 獨立行走或者昏迷； 5分：死亡。通過分 析本次實驗數(shù)據(jù)，得到假手術(shù)組和缺血再灌注組的皮質(zhì)與紋狀體 LC3II/ LC3 的統(tǒng)計 結(jié)果（如表 1 和圖 8 所示）。S ） 假手術(shù)組 腦缺血再灌組（ Ischemia/Reperfusion） 部位 (sham) 1h 3h 6h 12h 24h 皮質(zhì) 177。 177。 β actin 即 ― 肌動蛋白 ‖ ，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。 （ sham：假手 術(shù)組 。 177。 小鼠 Cortex 側(cè) Ischemia/Reperfusion 1h 與 sham 比 較 ： P ，無 統(tǒng)計 學(xué)差異 小鼠 Cortex 側(cè) Ischemia/Reperfusion 3h 與 sham 比 較 ： P ，有 顯 著的 統(tǒng)計 學(xué)意 義 小鼠 Striatum 側(cè) Ischemia/Reperfusion 1h 與 sham 比 較 ： P ，有 統(tǒng)計 學(xué)差異 小鼠 Striatum 側(cè) Ischemia/Reperfusion 3h 與 sham 比 較 ： P ，有 顯 著的 統(tǒng)計 學(xué)意 義 小鼠 Striatum 側(cè) Ischemia/Reperfusion12h 與 sham 比 較 ： P ，有 統(tǒng)計 學(xué)差異 （ Cortex：大 腦 皮 質(zhì) ； Striatum： 紋 狀體。** 177。 177。與假手術(shù)組比較，缺血再灌注 1 小時皮質(zhì) Beclin 1/ β actin 表達(dá)水平 升高但無統(tǒng)計學(xué)差異（ P ），再灌注 3 小時達(dá)到最高峰并有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異 （ P ），再灌注 6 小時后 Beclin 1/ β actin 活性逐漸下降；缺血再灌注 1 小 時紋 狀體 Beclin 1/ β actin 升高有統(tǒng)計學(xué)差異（ P ）， 3 小時達(dá)最高峰有顯著統(tǒng)計學(xué) 差異（ P ），再灌注 12 小時后 Beclin 1/ β actin 表達(dá)逐漸下降并有統(tǒng)計學(xué)意義（ P ）（如圖 10 所示）。** striatum 圖 8 小鼠缺血 側(cè) 皮 質(zhì) 和 紋 狀體 LC3 II/ LC3 I 的 變 化 趨勢 。 177。本 實驗 以 LC3II/ LC3I 的比 值 作 為統(tǒng)計 量，β actin 對計 算 結(jié) 果無影響，故未列出。 利用 Western blot 方法檢測左側(cè)大腦皮質(zhì) 和紋狀體的自噬標(biāo)志蛋白 LC3I、 LC3II 的表達(dá)情況（如圖 7 所示）。S 表示，采用 Graph Pad Instat 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，任意 2 組間比較用成組 t 檢驗，以 P 有統(tǒng)計學(xué)差異， P 有顯著差異。 8. 免疫熒光染色 免疫熒光染色所用石蠟切片?；謴?fù)至室溫后，在酶標(biāo)儀上用 562nm 波長比 色測 ，儀器取 2 孔平均值自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算出所測蛋 白濃度。 sham 組處理同 實驗組但不插線。麻醉后剪開 頭皮，暴露前囟，用激光多普勒血流 儀測量并記錄雙側(cè)大腦中動脈血流 (位置大約在前囟旁 3 毫米 )，結(jié)果取三次平均值。避光保存。 (3) 電泳緩沖液 25 mM Tris (pH )、 190 mM 甘氨酸、 % SDS。 2. 主要試劑 生化試劑： 甘氨酸（ glycine）、焦磷酸鈉（ sodium pyrophosphate； NaPPi）、 β磷酸甘油 （ βglycerophosphate）、對硝基苯磷酸二鈉（ pnitrophenyl phosphate， disodium； PNPPNa）、礬酸鈉（ sodium orthovanadate； Na3VO4）、抑肽酶（ aprotinin）、亮肽 素（ leupeptin ）、胃酶抑素（ pepstatin A ）、乙基苯基聚乙二醇 （ (Octylphenoxy)polyethoxyethanol； Nonidet P40， NP40）、牛血清白 蛋白（ bovine serum albumin ； BSA）、四乙基乙二胺（ N,N,N’,N’tetramethylethylenediamine ； TEMED）、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（ Markers）、苯甲基磺酰氟（ phenylmethyl sulfony1 fluoride； PMSF）和吐溫 20（ Tween20）均為 Sigma 公司產(chǎn)品。在營養(yǎng)缺乏 或能量需求高時，為了產(chǎn)生更多的能量和營養(yǎng)，自噬活性會大大提高。目前的研究觀察到 Beclin 1 蛋白主要分布在高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體膜和細(xì)胞核膜周圍 [13]。 LC3 前 體 ( ProLC3) 形成后，首先在 Atg4 同源物的催化下，其 C 末端 5 個氨基酸殘基被 切割下來，加工成胞漿可溶性形式 LC3I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸殘基， LC3I 接著在哺乳 動物 E1 泛素樣酶 Atg7 和 E2 泛素樣酶 Atg3 的催化下，經(jīng)泛素樣加工 修飾過程與（ PE）結(jié)合修飾成膜結(jié)合形式 LC3II。 Atg1 和 Atg9 蛋白調(diào)控其他 Atg 蛋白在自噬體 形成過程中在自噬體內(nèi)外的穿梭作用 [11]。 分子伴侶介導(dǎo)的自 噬 (Chaperonemediated autophagy,CMA) 與前兩者不同，沒有 形成膜性結(jié)構(gòu)的過程即不發(fā)生囊泡轉(zhuǎn)運，其典型特點是具有選擇性。 圖 2 自噬體的形成 過 程 Nat Rev Drug Discov 2022, 6: 304312 Figure 2 The formation process of autophagosome Nat Rev Drug Discov 2022, 6:304312 2 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 自噬的分類 根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運送到溶酶體內(nèi)的途徑不同，已確定自噬主要有 3種形式：大自噬、 小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬 [3]。在細(xì)胞死亡的過程中，可能 發(fā)生凋亡性程序性細(xì)胞死亡（ Apoptosis），自噬性程序性細(xì)胞死亡 (Autophagy)和細(xì) 胞壞死（ Nercrosis）三種類型 [1]。 結(jié)論 本結(jié)果提示小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后自噬表達(dá)上調(diào) 可能是一種保護(hù)機(jī)制，氧化應(yīng)激的激活與自噬表達(dá)相互影響，抗氧化劑 或自噬誘導(dǎo)劑可以通過激活細(xì)胞的自 噬途徑保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，減小腦梗塞 面積，減輕缺血神經(jīng)元的損傷。 tMCAO+rapamycin組于 術(shù)前 20分鐘側(cè)腦室立體定向注射 rapamycin， tMCAO+NAC組于腦缺血術(shù) 后立刻腹腔注射 NAC， tMCAO組于腦缺血術(shù)后立刻腹腔注射同容積生理 鹽水。 學(xué)位論文作者簽名： 日期： 年 月 日 上海交通大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué) 校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允 許論文 被查閱和借閱。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含 任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。 方法 采用線栓法制作小鼠短暫性大腦中動脈閉塞 (temporary middle cerebral artery occlusion， tMCAO)模型。與對照組相比， NAC干預(yù)后 LC3 II/ LC3 I 和 Beclin 1表達(dá)趨勢明顯升高。嚴(yán)重的后遺癥及很高的死亡率一 直困擾著醫(yī)療界，多年來缺乏新型的有效治療藥物。針對目前自噬檢測缺乏統(tǒng) 一標(biāo)準(zhǔn)的問題，《 Autophagy》雜志在 2022 年第二期，刊登 了主編 Daniel 聯(lián)合世 界 上 200 多名自噬研究領(lǐng)域?qū)＜易珜懙木C述文章 ― Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes‖ 。與大自噬不同，小自噬通過溶酶體膜自身 變形來包裹和降解胞漿內(nèi)容物。 (3)兩條泛 素樣接合系統(tǒng)， Atg12 和 LC3(LC3 與酵母 Atg8 蛋白同源 )。 Atg4 是一種半胱氨酸天冬氨酸酶， 它首先將 Atg8 羧基端部分氨基酸殘基裂解，顯露其氨基乙酸末端，使 Atg8 通過酰 胺鍵與 PE 結(jié)合。當(dāng)哺乳動物細(xì)胞發(fā)生自噬時，細(xì)胞內(nèi) LC3 的 含量及 LC3I 向 LC3II 的轉(zhuǎn)化均明 顯增加。 TOR 激酶 自噬調(diào)控的一個靶點是 TOR 激酶 (Target of Rapamycin kinase)。鑒于此，本文通過建立小鼠的短暫性局灶性腦缺血再灌注 模型，模擬人類缺血性腦血管疾病的作用機(jī)制，利用分子生物學(xué)技術(shù)及免疫熒光染 色等自噬研究方法檢測檢測腦缺血再灌注損傷過程中自噬相關(guān)蛋白 LC3及 Beclin 1 的表達(dá)變化，探討自噬在缺血性腦血管疾病的調(diào)控表達(dá)機(jī)制 ，為缺血性腦血管疾病 的治療提供新的研究方向。 PMSF，雙氫溴乙啶 (Dihydroethidium， DHE)為碧云天產(chǎn)品。 (10) 一抗及二抗工作液 用于 Western blot： 兔抗 Beclin 1 ：用 1ΧTBST 稀釋，比例為 1： 1000 兔抗 LC3 ：用 1ΧTBST 稀釋，比例為 1： 1000 鼠抗 βactin ：用 1ΧTBST 稀釋，比例為 1： 500 抗兔 IgG 二抗（ HRP）：用 1ΧT