【正文】 rary middle cerebral artery occlusion 短 暫 性 大 腦 中動(dòng)脈閉塞 TOR kinase Target of rapamycin kinase 雷 帕 霉 素 靶 點(diǎn)激酶 TBI Traumatic Brain Injury 創(chuàng) 傷 性 腦 損 傷 Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane 三 (羥甲基 )氨 基甲烷 TTC 2,3,5Triphenyltetrazolium chloride 2， 3， 5氯化 三苯四氮唑 Tween20 Tween20 吐溫 20 VII 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一部分： 腦缺血再灌注損傷后自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)及 調(diào)控機(jī)制 引 言 腦血管疾病是神經(jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)疾病和多發(fā)病，是人類嚴(yán)重病殘和死亡的重要原 因之一，其中又以缺血性腦血管疾病的發(fā)病率居首位。 TTC染色提 示 NAC或 rapamycin處理后可減小梗塞面積。 NAC和 Rapamycin分別干預(yù)缺血再灌 I 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 注 24小時(shí)小鼠，腦片 2,3,5氯化三苯四氮唑 (2,3,5triphenyltetrazolium chloride， TTC)染色觀察腦梗塞面積。后者隨機(jī)分 tMCAO+ 生理鹽水、 tMCAO+rapamycin和 tMCAO+NAC。 本學(xué)位論文屬于 不保密 □。本人完全意識(shí)到 本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2022 級(jí)碩士研究生學(xué)位論文 腦缺血再灌注損傷后氧化應(yīng)激對(duì)自噬調(diào)控機(jī)制的研究 導(dǎo) 師 姓 名：卞留貫 教授 研究生 姓 名：王文靜 學(xué) 號(hào)： 1087209099 專 業(yè)：神經(jīng)外科學(xué) 答 辯 時(shí) 間： 2022 年 5 月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2022 級(jí)碩士研究生學(xué)位論文 腦缺血再灌注損傷后氧化應(yīng)激對(duì)自噬調(diào)控機(jī)制的研究 導(dǎo) 師 姓 名：卞留貫 教授 研究生 姓 名：王文靜 學(xué) 號(hào)： 1087209099 專 業(yè)：神經(jīng)外科學(xué) 0 究 方 向：腦缺血再灌注損傷 0 鍵 詞：腦缺血再灌注；自噬；氧化應(yīng)激； Beclin1； LC3； NAC 申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士 0 辯 時(shí) 間： 2022 年 5 月 0 養(yǎng) 單 位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 基 金 資 助：上海市科委重點(diǎn)課題資助項(xiàng)目 （項(xiàng)目編號(hào)： 09JC1409700。對(duì)本文的研究做出 重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。 保密 □，在 年解密后適用本授權(quán)書。實(shí)驗(yàn)分為假 手術(shù)組 (sham 組 )、缺血再灌注組（ ischemia/reperfusion， I/R組）。利用雙氫溴乙啶 (Dihydroethidium， DHE)染色檢測(cè)細(xì) 胞內(nèi) ROS水平及對(duì)自噬活性的影響，借助熒光顯微鏡觀察 NAC或雷帕霉 素 (Rapamycin)條件下的自噬變化。 DHE染色結(jié)果顯示缺血再灌注損傷 1小時(shí) 后即開(kāi)始出現(xiàn) ROS活性增高，經(jīng) NAC處理后可被部分抑制。AMPactivated protein kinase 539。自噬作為存在于真核細(xì)胞內(nèi)的 一種溶酶體依賴 性的胞內(nèi)降解途徑，與神經(jīng)元存活 /死亡密切相關(guān)，其在腦缺血再 灌注損傷過(guò)程中參與的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制已經(jīng)成為目前神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的重點(diǎn)之一。 近年來(lái)，另一種新的細(xì)胞死亡方式 —自噬性程序性細(xì)胞死亡吸引了科學(xué)家們的關(guān)注 被稱為 II 型程序性細(xì)胞死亡。目前，自噬繼 凋亡之后已逐漸成為學(xué)科各領(lǐng)域研究的重要發(fā)展方向。大自噬通常在外界環(huán)境壓力或者內(nèi)環(huán)境變化刺激下激 活，一方面利用降解成的核苷、氨基酸和脂肪酸合成新的大分子和 ATP，維持細(xì)胞 的正常代謝和生存，另一方面它可以選擇性地清除某些細(xì)胞成分，維持細(xì)胞自我穩(wěn) 態(tài)。小自噬主要參與細(xì)胞在正常情況下細(xì)胞器的降解 [5]， 此外小自噬還可以選擇性降解細(xì)胞內(nèi)多余的細(xì)胞器，如某些藥物可以誘導(dǎo)過(guò)氧化物 酶體增生，而小自噬則可以選擇性的降解這種細(xì)胞器來(lái)維持細(xì)胞器的正常數(shù)目 [6]。 2. 自噬的調(diào)控機(jī)制 參與自噬體形成的兩個(gè)泛素樣蛋白系統(tǒng) 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬的自噬泡形成過(guò)程中與自噬相關(guān)基因（ ATG)有關(guān)，即依 賴于 兩個(gè)泛素樣結(jié)合系統(tǒng) ——Atg12Atg5 和 Atg8 系統(tǒng)。在自噬體形成的起始階 段， Atg12 結(jié)合 Atg5，并促進(jìn) LC3 與磷脂酰乙醇胺 的結(jié)合來(lái)促進(jìn)自噬體的延伸 [10]。 Atg12 首先由 E1 酶 Atg7 活化，之后轉(zhuǎn)運(yùn)至 E2 酶 Atg10，最后與 Atg5 泛素化結(jié)合，形成 Atg12Atg5 復(fù)合物也稱為自噬體前體 ( autophagosomal precursor) 。結(jié)合之后， Atg8 即緊密附著于自噬小體膜上。電泳過(guò)程中， LC3II 的遷移速率要快于 LC3I。因此，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) LC3II 或者 LC3II/LC3I 的含量，可以方便地判斷 細(xì)胞自噬的活性變化。 PI3K 在自噬前體復(fù)合物的形成以及自噬小 體膜的來(lái)源中發(fā)揮重要作用 [14]。在存在生長(zhǎng)因子 和營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩的情況下，酪氨酸激酶受體通過(guò) PI3K/Akt 信號(hào)通路活化 TOR 激酶來(lái)抑 制自噬 (如圖 3 所示 )。同樣在多種 病理情況下如感染、癌癥、神經(jīng)退行性變以及衰老、心臟病等，自噬起到了防護(hù)作 用。 6 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 材料和方法 1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性健康 CD1 小鼠 36 只，體重（ 2530） g，清潔級(jí)，購(gòu)自上海西普爾 必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。 甲叉雙丙烯酰胺（ N,N’methylenebisacrylamide） , 2， 3， 5氯化三苯四氮唑 (2,3,5triphenyltetrazolium chloride， TTC)為 Fluka， SigmaAldrich 公司產(chǎn)品。 Cocktail 為 Thermo scientific 產(chǎn)品。 (5) 洗滌緩沖液（ TBST） 10 mM TrisHCl (pH )、 100 mM NaCl、 % Tween20。 60℃ 加熱 溶解后，自然冷卻， 4℃ 保存 (12) 2%TTC TTC、生理鹽水。 (15) DHE 染色液 原液為 100mg/ml 用 DMSO 稀釋的，現(xiàn)在的儲(chǔ)存液為 ，然后按照 1:100 PBS 稀釋成 5μg/ml 的工作液。每組 9 只。從頸外動(dòng)脈 ( ECA)或頸總動(dòng)脈 (CCA)分叉處剪一切口， 插入預(yù)先制備的硅膠包被的 70 線栓，結(jié)扎分叉處縫線后剪斷血管，松開(kāi)頸內(nèi)動(dòng)脈 縫線，進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈 ( ICA ) 約 11mm， 阻斷大腦中動(dòng)脈 (MCA)起始段，短暫結(jié)扎分 叉處縫線，再松開(kāi)頸總動(dòng)脈縫線。腦缺血 60 分鐘后，分別再灌注 1 小時(shí)， 3 小時(shí)， 6 小時(shí)， 12 小時(shí)， 24 小時(shí)。蛋白樣品制備（以下操作均在冰水浴 中進(jìn)行）：從液氮中取出標(biāo)本，按照 100μl/10mg 加入勻漿緩沖液（ 1ΧRIPA），使用 前加入蛋白酶抑制劑 (PMSF、 Coctail)，（ 1ΧRIPA、 1ΧCocktail、 1ΧPMSF 按照 100： 1： 1 比例）用超聲波細(xì)胞破碎儀勻漿 20 秒，放置于冰上 30 分鐘，離心機(jī) 12022rpm， 4℃ ，離心 25 分鐘，小心移取上清液，按 BCA 法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè) 定蛋白濃度，分裝，置 80℃ 冰箱待用。 2. 96 孔板每孔加入 200μl 的工作液，再每孔加入 10μl 的標(biāo)準(zhǔn)品，每種標(biāo)準(zhǔn)品加 2 孔，再加入待測(cè)蛋白樣品 (1:20 稀釋 ) 10μl，也加 2 孔。取等量的變性蛋白質(zhì)樣品（ 25μg），用 BioRad 公司的專用配 膠槽，配制 12％、 4％濃度的十二烷基磺酸鈉－ 聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfatepolyacrylamidegel electrophoresis， SDSPAGE)。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光 顯色系統(tǒng)（美國(guó) Pierce）即加入新鮮配制的 ECL 顯色液后顯示蛋白條帶， BioRad 14 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)顯影。之后將腦片置于逐級(jí)升高的梯度酒精中（ 70%、 80%、 90%、 95%、 100%）脫水，二甲苯透明，在 60℃ 電熱恒溫水箱融化的石蠟中浸泡 1小 時(shí)后包埋， 4℃ 過(guò)夜。甘油封 片，樣品在激光共聚焦顯微鏡下掃描，光源分別用 488 nm 和 561 nm波長(zhǎng)的激光器激 發(fā)綠色和紅色熒光，掃描分辨率為 1024 Χ1024 pixel，計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集，數(shù)字成像。假手術(shù)組無(wú)上述變化。（如圖 6所示） 圖 6 tMCAO 24 小 時(shí) 的小鼠 Figure 6 mouse in 24h of tMCAO 2．小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后缺血側(cè)皮質(zhì)和紋狀體的 LC3I、 LC3II 蛋白表達(dá) 變化 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為假手術(shù)組和缺血再灌注組。 LC3II 的數(shù)量與自 噬體的數(shù)量成正相關(guān)，在某種程度上可反映了細(xì)胞的自噬活性。 LC3I、 LC3II 蛋白表達(dá)上調(diào)表明腦缺血再灌注損傷后大腦皮 質(zhì)和紋狀體的自噬活性升高。 Ischemia/Reperfusion：缺血再灌注） Figure 7 The Western blot oute of LC3 I、 LC3 II in cortex and striatum . In this experiment, LC3II / LC3I ratio as a statistic, βactin had no effect on the results,which is not listed. 表 1 各 組 小鼠缺血 側(cè) 皮 質(zhì) 和 紋 狀體 LC3 II/ LC3 I 表達(dá)水平的比 較 （ 177。 177。** cortex 紋狀體 177。* 177。 * P ， ** P ） Figure 8 The trend of LC3 II/ LC3 I in cortex and striatum Compare Ischemia/Reperfusion 6h tosham in Cortex: P , No significant difference Compare Ischemia/Reperfusion 12h to sham in Cortex: P , Significant statistical significance Compare Ischemia/Reperfusion 6h tosham in Striatum: P , statistical significance 18 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 3．小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后缺血側(cè)皮質(zhì)和紋狀體的 Beclin 1 蛋白表達(dá)變化 用上述同樣方法觀察缺血再灌注后 1 小時(shí)、 3 小時(shí)、 6 小時(shí)、 12 小時(shí)、 24 小時(shí) Beclin 1 的蛋白表達(dá)趨勢(shì)（如圖 9 所示）。所以本次實(shí)驗(yàn)借 助 Western blot 方法檢測(cè) Beclin 1 和 β actin 的表達(dá)水平，以 Beclin 1/ β actin 的比值 作為統(tǒng)計(jì)量，可對(duì)細(xì)胞的自噬活性進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和判斷。 圖 9 小鼠缺血 側(cè) 皮 質(zhì) 和 紋 狀體 Beclin 1 的 Western blot 表達(dá) 結(jié) 果。 S） Table 2 Comparison of Beclin 1/ βactin in cortex and striatum in mice groups （ 177。** 177。 177。* 1