【正文】 系全籽粒蛋白。如圖 25中的 6和圖 26中的 2所示。 可以看出，不育系和保持系籽粒的酸溶蛋白 條帶在各個區(qū)域都非常相似，其差別只是表現(xiàn)在個別蛋白條帶的強度上，在水溶和鹽溶蛋白條帶中也是如此。 。 重復(fù) DNA區(qū)域有兩 個可讀框， 所編 碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列和與 C型胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的 蛋白質(zhì)有部分同源性，可能 蛋白質(zhì) 是造成 S型 胞質(zhì)雄性不育的原因 。 關(guān)于植物 CMS的形成機理，基于玉米細胞核基 因提出 了“代謝”假說 和“互作”假說 ； 基于植物細胞質(zhì)基因提出了線粒體 RNA編輯假說 。 在實驗具體操作期間， 也 得到了 各位師兄師姐 的大力協(xié)助，在此深表謝意。所以差異蛋白質(zhì) 與細胞質(zhì)雄性不育關(guān)系研究 ， 尚有待于相關(guān)技術(shù)的改進和玉米線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)研究的進一步深入 。 而 雄性不育系 CMSP與其保持系 葉片表達蛋白的一致性，也證實了其同一的核背景。 1 2 3 4 5 6 7 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第三章 討論 17 第三章 討論 陳偉等人 （ 2022） 已對 玉米細胞質(zhì)雄性不育材料 CMSP胞質(zhì) 進行了 分類研究 ，經(jīng) 育性恢復(fù)專效性測定、 PCR分類鑒定、類質(zhì)粒鑒定 ，將 CMSP歸為 S型不育胞質(zhì) 類型 。這也是和蘇萍等人在比較研究 玉米蛋白質(zhì)組分 電泳特性 時的結(jié)果是一致的。 玉米 CMS 與相應(yīng)保持系 籽粒 蛋白提取 法 比較 由于前面試驗中發(fā)現(xiàn)醇溶法提取蛋白不能形成電泳譜帶，可能是由于乙醇密度較低，導(dǎo)致在緩沖液條件下無法進膠所致，所以在不育系和保持系籽粒蛋白提取法比較中，不再設(shè)乙醇法提取蛋白組。 22天后胚蛋白。 1 2 3 4 5 6 7 8 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第二章 玉米 CMS和保持系 生殖器官及其他組織蛋白質(zhì)比較 15 圖 26 保持系與不育系籽粒不同提取蛋白對比 18天后胚乳蛋白。丙酮法提取蛋白后， SDSPAGE電泳，考馬斯亮藍染色后觀察。 22天后的胚乳 蛋白 。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第二章 玉米 CMS和保持系 生殖器官及其他組織蛋白質(zhì)比較 14 玉米 CMS 和 相應(yīng)保持系 花絲 蛋白質(zhì)組 比較 同取保持系和不育系的已套袋雌穗的幼嫩花絲，液氮研磨成粉。 。 玉米 CMS 的 相應(yīng)保持系 花 粉 蛋白質(zhì)組研究 由于保持系的蛋白表達較為明顯，故 取保持系已套袋雄穗的 花粉 ，液氮研磨成粉。 在可識別程度下，可以認為保持系花粉蛋白質(zhì)表達條帶顯示的蛋白與不育系相比呈上調(diào)表達的現(xiàn)象。 1mg/450181。 1mg/450181。L。但由于濃度過大，無法排除是由其它雜質(zhì)成分的存在造成的假象的可能。回收染液， 加洗液脫色12h。 蛋白溶液上樣前 95100℃熱變性 3min。真空干燥 30min。 分別取不育系與保持系 的葉片、 花藥 、 花絲、幼嫩籽粒、嫩穗軸、籽粒胚部分、籽粒胚乳部分以及全籽粒等 對應(yīng) 組織 材料 ， 用液氮在預(yù)冷的研缽中研碎成細粉末， 進行下一步實驗 。通過在基因組 DNA文庫中篩選及免疫雜交分析，表明這是一個新基因家族，編碼高度親水、具有雙重結(jié)構(gòu)的蛋白域的蛋白質(zhì)，并可受 ABA誘導(dǎo)在不同組織中的表達。 Wiren等（ 1997）在另一項研究中比較了野生型和鐵攝取缺陷型突變體的蛋白質(zhì)圖譜， 確定了 4個與鐵離子跨膜運輸有關(guān)的多肽。正是這種不同的蛋白質(zhì)組構(gòu)成了這一時刻的特征性生命活動的基礎(chǔ)。但在短時間內(nèi)建立完整的數(shù)據(jù)庫難以實現(xiàn)。 由此可見，離體翻譯技術(shù)采用靈敏度高，獨立得到細胞器表達產(chǎn)物，為 CMS機理研究提供了更可靠、更直接的實驗證據(jù)。 細胞質(zhì)雄性不育 的 分子研究 對 CMS的分子水平的研究大致有兩個方面，核酸和蛋白質(zhì)。 不育的核基因 MS與不育胞質(zhì) S相互作用產(chǎn)生不育性，育性恢復(fù)基因 Rf特異的與 S胞質(zhì)相互作中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第一章 前言 6 用則導(dǎo)致雄性可育， Rf基因沒有鑒別出來之前，雄性不育系常被認為是細胞質(zhì)類型的，隨著 Rf基因的發(fā)現(xiàn)和鑒別，這種不育類型實際上是一種核質(zhì)互作現(xiàn)象 。 玉米上已發(fā)現(xiàn)了 60 個核不 育基因，大多數(shù)是隱性，與細胞胞質(zhì)不育比較，細胞核不育有 3個優(yōu)點： 1）育性穩(wěn)定，基本屬于無花粉型； 2）育性正常的自交系都是其恢復(fù)系，不育基因可以轉(zhuǎn)移到任何核背景中，實現(xiàn)雜交組合的自由組配； 3）不存在因細胞質(zhì)單一化而導(dǎo)致病原菌小種轉(zhuǎn)化感染的危險。 本實驗 計劃 用差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究一個新發(fā)現(xiàn)的玉米 細胞質(zhì)雄性不育 材料 CMSP及其對應(yīng) 保持系 生殖 器官蛋白質(zhì)組 學(xué)的差異，以期在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上找到這個新型玉米細胞質(zhì)雄性不育突變體在性器官發(fā)育上引起不育的蛋白質(zhì)組學(xué)差異 。雄性不育植株作為育性基因的突變體，它又是進行雄蕊和花粉發(fā)育研究，育性基因表達調(diào)控研究以及雌雄異株植物起源與進化研究的極好材料。 徐尚忠等（ 2022）對 C、 T、 S三種雄性不育組別進行了線粒體 DNA的 RFLP分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在COXII/BamHI探針 /酶組合下，正常胞質(zhì)在 ,T組不育胞質(zhì)則在 5Kb 有一條帶 ,從而說明了這三種不同胞質(zhì)不育類型在 mtDNA的 RFLP圖譜上的不同反應(yīng)。這個 RNA片斷能翻譯出一個正常的多肽，因而導(dǎo)致不育。 Forde的后繼研究證實 TCMS確實合成了特異 13kDa的多肽，與之相比，正?？捎陝t特異的合成一種 21kDa的多肽，這在以往結(jié)果中沒有檢測到。采用蛋白質(zhì)組分析方法，不但可以確定在導(dǎo)致這種變化的過程中，究竟有哪些蛋白質(zhì)在表達、其表達量如何、以及翻譯后有無修飾等特征，而且可以通過將同種生物的多種不同部位和不同狀態(tài)的細胞樣品或相關(guān)生物的同狀態(tài)細胞樣品進行比較，來識別出那些在質(zhì)和量上發(fā)生特異性改變的蛋白質(zhì)。一個生物體在經(jīng)歷生長發(fā)育及各種生理過程，其基因組通常是始終維持穩(wěn)定不變的，也即它可能表達的全部蛋白質(zhì)的總和也是不變的，而其蛋白質(zhì)組的構(gòu)成卻在隨時發(fā)生著嚴格而活躍的改變。 Damerval和 Guilloux（ 1998）在研究玉米 opaque2突變體時，考察了 7個不同背景的近等基因系胚乳蛋白質(zhì)表達情況，發(fā)現(xiàn)有 36個多肽的豐度發(fā)生變化，這其中 17個在突變體中含量下降，其余的 19個多肽則含量上升。通過質(zhì)譜法共鑒定了 46個蛋白質(zhì)，均為植物中首次 得到鑒定。 蛋白質(zhì)是基因 表 達的產(chǎn)物，在蛋白質(zhì)組水平上探討細胞質(zhì)雄性不育的機理，尋找與細胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的蛋白質(zhì)，進而找到相應(yīng)基因，具有重要的理論和實踐意義，因此本 研 究擬對 玉米新型 CMSP 及其同型保持系開展 花器官等組織差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究， 找到差異表達蛋白，為探索玉米細胞質(zhì) 雄性不育的機理提供線索。離心后倒掉上清，沉淀塊真空凍干。 SDSPAGE蛋白 電泳 25mL 樣品溶液： 尿素 60mM DTT %Triton X100 %溴酚蘭 幾小粒 SDSPAGE Running buffer （ 5X） TrisCl Glycine 94g 10%SDS 50ml 加水至 1000mL 12%分離膠 5mL： 水 30%丙烯酰胺混合液 （ ） 10%SDS 10%過硫酸銨 TEMED 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第二章 玉米 CMS和保持系 生殖器官及其他組織蛋白質(zhì)比較 11 5%積層膠 2mL： 水 30%丙烯酰胺混合液 （ ） 10%SDS 10%過硫酸銨 TEMED 考馬斯亮藍染液 1L（洗液中不加入考馬斯亮藍 R250） ： 考馬斯亮藍 R250 甲醇 450mL 冰醋酸 100mL 蒸餾水