【正文】 成功地實現(xiàn)育種策略的基礎(chǔ)?？赏ㄟ^類似但不同的方法來實現(xiàn)： ①延長特定的代謝途徑； ②引入新的代謝分支途徑； ③從特定生物引入的全新的途徑。 2021/6/21 82 棒狀桿菌的代謝調(diào)節(jié)相對簡單。關(guān)于谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌的代謝途徑工程研究的成果已見發(fā)表 。最近發(fā)現(xiàn)，芳香族氨基酸的吸收系統(tǒng)過量表達的結(jié)果是相應(yīng)氨基酸的吸收的增加，實際上產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率降低了。盡管采用細菌來生產(chǎn)氨基酸往往可以獲得極高的胞外氨基酸濃度，人們卻并未意識到這至少部分是由于細胞向載體系統(tǒng)所催化的分泌反應(yīng)提供了代謝能的結(jié)果。 下圖為在 不同轉(zhuǎn)化率時的理論流量分布圖 。這是這類方法的局限性。 2021/6/21 55 如果要對代謝網(wǎng)絡(luò)做出完整描述并且對各步反應(yīng)及其代謝物流量的重要程度做出評價，就要弄清每一個酶的的調(diào)節(jié) (包括對酶的活性的調(diào)節(jié)和對表達水平的調(diào)節(jié) )情況，這當然是不容易如愿的，但已被實踐證明，以下簡化的策略也可以用來對代謝流進行定量的描述。因此，可以認為 高的能量耗散能力適合于代謝中間產(chǎn)物 (如氨基酸 )的過量合成 。 好幾個術(shù)語，如 “ 解耦聯(lián) ”、“ 代謝能溢出 ” 等就是用來說明這種靈活性的。 在緩慢生長或非生長條件下，有目的地控制底物的吸收與代謝的速率，能提高發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)效率。許多方法可誘導(dǎo)其分泌，包括生物素亞適量法 (用于谷氨酸生產(chǎn)的谷氨酸棒桿菌是生物素缺陷型 )、添加胺類表面活性劑 (如吐溫 40和 60)、在菌體生長期添加青霉素、甘油或脂肪酸缺陷菌株在限制條件下生長和采用溫度敏感突變株等。 2021/6/21 32 氨基酸的生產(chǎn)中經(jīng)常用到特定的氨基酸營養(yǎng)缺陷型菌株。 2021/6/21 27 Glc PEP PYR AcCoA OAA ① ② ③ G6P Glc ④ ⑤ ⑥ 注： ① PK, ② PC, ③ PEPC, ④ PEPCK, ⑤ OAADC, ⑥ PEPS, ⑦ PTS 奇異三角區(qū) ⑦ 2021/6/21 28 PEP通過 PYR和 AcCoA向 TCA環(huán)提供 C2單位，同時， PEP、 PYR 以及 AcCoA 還通過回補反應(yīng) （ 通過乙醛酸環(huán)）為 TCA環(huán)提供重要中間產(chǎn)物，這些回補反應(yīng)對于以 TCA環(huán)代謝中間產(chǎn)物 為前體的氨基酸的生產(chǎn)來說是非常必要的。 人們最初認為這個酶在谷氨酸棒桿菌中并不存在。要獲得令人滿意的結(jié)果，必須全面考慮這些方面，僅僅對于個別反應(yīng) (即便是最重要的調(diào)控點 )進行改造并不是理想的方法， Broer 等曾將脫敏的 AK的基因?qū)胍吧羞M行表達，但并未獲得很令人滿意的賴氨酸產(chǎn)量。 2021/6/21 16 谷氨酸棒桿菌中賴氨酸的合成是研究得最為廣泛的。這既涉及到中心代謝途徑（提供碳架物質(zhì)、還原力及代謝能）的代謝流的定量分析，又涉及到特定氨基酸專用的合成途徑的代謝流的定量分析。這涉及到底物進入細胞的碳架物流量，流經(jīng)向心途徑、中心代謝途徑和離心途徑的碳架物流量，以及代謝中間產(chǎn)物流出細胞的 碳架物流量 (the central and peripheral carbon fluxes)。 還原力的流量 (redox flux)及 能量流量 (energy flux)。 2021/6/21 10 此外，底物吸收和目的產(chǎn)物輸出等有方向性的跨膜反應(yīng)對于氨基酸的生產(chǎn)也是極其重要的。 圖 2 列出了谷氨酸棒桿菌中天冬族氨基酸生物合成相關(guān)的途徑及重要步驟的代謝調(diào)節(jié)情況。 2021/6/21 20 該途徑上另一值得關(guān)注的特征是從六氫吡啶二羧酸出發(fā)合成二氨基庚二酸的旁路途徑的出現(xiàn)，借助于 NMR 手段已經(jīng)得知，旁路的出現(xiàn)依賴于某些代謝條件，特別是可利用的NH4+的存在。正因為如此，才出現(xiàn)了這樣的假設(shè)，即： TCA 環(huán)在該處的中斷引起 α 酮戊二酸的 “ 溢出 ”， 最終導(dǎo)致谷氨酸的分泌 。 2021/6/21 29 該區(qū)包含可能有多達七個酶的參與，其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 (PEPCK)、 丙酮酸激酶 (PK)、 草酰乙酸脫羧酶(OAADC)和磷酸烯醇式丙酮酸磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng) (PTS)都已得到鑒定，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶 (PEPS)已被假定存在。一方面，在分成兩支的氨基酸合成途徑中，一個分支途徑的終端產(chǎn)物氨基酸的營養(yǎng)缺陷，通常對另一分支的終端產(chǎn)物氨基酸的合成起促進作用。 2021/6/21 38 很顯然，所使用的這些方法都對細胞質(zhì)膜或細胞壁有一定影響，但使細胞膜通透性發(fā)生變化的機理是不完全一樣的。因此，要用分子技術(shù)或生化技術(shù)對此進行深入細致的研究，以闡明在限制生長條件下，微生物的生理背景同工業(yè)發(fā)酵過程的應(yīng)用必定密切相關(guān)的道理。 2021/6/21 46 實際上，曾有人這樣描述過細菌的這種行為：“可以推斷，細菌對于代謝能過剩的解決辦法是把它浪費 /用掉”。 2021/6/21 49 （ 5）有關(guān)滲透適應(yīng)性問題： 在分批培養(yǎng)的條件下，發(fā)酵液中溶質(zhì) (碳源和能源 )的濃度會發(fā)生很大的變化，那么了解和控制有關(guān)滲透適應(yīng)性的代謝過程顯然就相當重要了。 2021/6/21 56 第一種方法，在某些場合下用代謝控制理論來對有關(guān)生物技術(shù)學(xué)的研究進行反應(yīng)動力學(xué)的分析。為了彌補這種局限性，近年已有幾種技術(shù)用到這種類型的分析中去了。 2021/6/21 64 G6PF6PPEPPYRAcCoARu5PGlcCO2OAALys1001511837982100515303317331158520A. 平衡生長G6PF6PPEPPYRAcCoARu5PGlcCO2OAALys10069499100633512812835B. YLys/Glc=35%G6PF6PPEPPYRAcCoARu5PGlcCO2OAALys100150507510025750075C. YLys/Glc=75%CO2 CO2 CO2 5 125 2021/6/21 65 課外學(xué)習(xí)參考資料： Metabolic Pathway Synthesis (p288) Metabolic Flux Analysis (p309) in Metabolic Engineering, 1998 Metabolic Flux Balance Analysis (p13) in Metabolic Engineering, 1999 2021/6/21 66 3. 底物的跨膜吸收與氨基酸的跨膜輸出 底物的吸收和產(chǎn)物的輸出對于氨基酸的生成是非常重要的。這一點已被有關(guān)賴氨酸和異亮氨酸分泌的研究所證實 。總之，深入了解氨基酸吸收和分泌的能學(xué)及調(diào)控的機理對于定量地理解氨基酸的生產(chǎn)過程是極為重要的。 2021/6/21 77 為提高色氨酸的產(chǎn)量 ， 已對谷氨酸棒桿菌按部就班地進行了一系列的遺傳調(diào)節(jié) ， 包括：色氨酸操縱子 (已被解除調(diào)節(jié)的 )的基因的過量表達 、去除調(diào)節(jié)子及弱化序列的控制；切斷通往苯丙氨酸和酪氨酸的支路 、 增加前體物如 PEP、 E4P和絲氨酸等的供應(yīng) 、 破壞色氨酸酶降解色氨酸的活性等等 。腸道細菌中特定反應(yīng)的酶及特定基質(zhì)的載體系統(tǒng)具有多重性，而棒狀桿菌中則沒有；棒狀桿菌的代謝調(diào)控模式也比大腸桿菌要簡單得多。 2021/6/21 87 盡管谷氨酸棒桿菌中通往賴氨酸的流量控制點主要分布在天冬氨酸激酶、 DDP合成酶和賴氨酸分泌系統(tǒng)，但如果考慮到通往蘇氨酸和異亮氨酸的途徑，情況就更加復(fù)雜了。這些代謝擷頏物的抗性突變株的突變，常常是發(fā)生在一個反饋調(diào)節(jié)的主要反應(yīng)步驟 (一般被叫做“代謝瓶頸” )所對應(yīng)的基因上。這對于有目的的代謝設(shè)計是有重要意義的 。 2021/6/21 101 當引入新的途徑或者改變已建立的代謝途徑上代謝流的流向時，除了要考慮碳架流，還考慮氧化還原平衡和代謝能平衡。在氨基酸生產(chǎn)方面，因為關(guān)于還原力平衡的問題已有一些討論，能量平衡問題就常常被忽略。 2021/6/21 111 氨基酸分泌系統(tǒng)的存在，以及其生理重要性，直到最近才得到闡明。 2021/6/21 115 目前研究的另一方面是，將大腸桿菌和釀酒酵母中已經(jīng)非常成熟的分子生物學(xué)工具，應(yīng)用到工業(yè)微生物尤其是格蘭氏陽性菌中，如谷氨酸棒桿菌。