大腸桿菌耐喹諾酮類機制分子生物學基礎的初步研究-文庫吧在線文庫
【正文】 引物各 2ul，余同第一次 PCR反應體積。 觀察結(jié)果 。 該酶由 A、 B兩個亞單位組成 。本研究表明大腸桿菌標準株和敏感株gyrA基因電泳后在同一位置，堿基未發(fā)生變化。 分子克隆實驗指南 。 23 討論（ 3）續(xù) ? 本研究發(fā)現(xiàn)的 gyrA基因氨基酸184位點 C→A 堿基突變致組氨酸突變?yōu)闊o冬酰氨尚未見文獻報道，因此我們認為我院分離的大腸桿菌對氟喹酮類藥物產(chǎn)生耐藥性與gyrA基因的點突變有關。 國外研究以發(fā)現(xiàn) gyrA基因突變位點集中發(fā)生在 N末端核苷酸序列為199318的區(qū)間內(nèi) ， 即所謂氟喹喏酮類藥物耐藥決定區(qū) 。 14 15 結(jié)果（ 3） DNA測序結(jié)果及推定氨基酸序列 （ 1） A株在 gyrA基因堿基序列的第259位有 G→A 突變 ， 致 Asp87→Asn 。 8 材料和方法（ 5） GyrAPCR產(chǎn)物的單鏈構象多態(tài)性（ SSCP） 分析： 取第二次 PCR產(chǎn)物 5ul， 94%去離子甲酰胺和溴酚藍各 5ul混勻后置85℃ 水浴變性 5分鐘 ， 然后迅速放入 0℃ 冰水中使 DNA處于單鏈狀態(tài) 。胰化蛋白胨酵母浸膏、NaCl、瓊脂糖、甲醇、甲醛、乙酸、重鉻酸鉀、硝酸銀、酚、氯仿等為國內(nèi)分析純試驗。大腸桿菌標準株 ATCC25922購自中國藥品生物制品檢定所。為了了解大腸桿菌對其耐藥的分子生物學機制，我們對 6株耐藥菌 1株敏感菌和 1株標準株（ ATCC25922）的gyrA基因的 N末端編碼區(qū)進行了 PCRSSCP及序列測定分析以檢測 gyrA基因突變。合成儀為 Beckman Oli go1000型。 PCR條件： 94℃ 預變性 5分鐘；94℃ 1分鐘， 56℃ 1分鐘， 72℃ 45秒，共35個循環(huán)。 10 材料和方法（ 6） PCR產(chǎn)物測序 利用 WizardPCR產(chǎn)物純化試劑盒，按產(chǎn)品說明純化 gyrA產(chǎn)物，純化
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