【正文】 不均等分裂是細胞極性建立的標志。⒉直接分化芽和根。誘導不定芽。對于多年生植物而言，以幼嫩組織為材料無論是誘導還是分化均較容易。其六，可以在不附加任何激素的培養(yǎng)基上萌發(fā)。胚狀體原始細胞特征：原生質(zhì)濃厚，細胞核較大，處于細胞質(zhì)中央。原生質(zhì)體研究進展 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)研究中幾個值得提出重要成就：制備原生質(zhì)體的外植體、預處理及分離措施用于分離原生質(zhì)體的常用材料是無菌試管苗葉片,上胚軸和子葉, 缺點：是原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進一步的生長和發(fā)育。液體－固體雙層培養(yǎng)即在培養(yǎng)皿的底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。 細胞分裂和生長 原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)天后，胞質(zhì)增加，細胞器增殖，RNA、蛋白質(zhì)及多聚糖合成增加，不久即可發(fā)生核的有絲分裂及胞質(zhì)分裂。1影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素 基因型 較早的試驗曾證明矮牽牛葉肉原生質(zhì)體的不同生長發(fā)育時期是受不同基因所控制的。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。 1 原生質(zhì)體的融合 方法 PEG誘導融合的特點：其優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊設備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。 電融合的基本過程： 細胞膜的接觸當原生質(zhì)體置于電導率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串； 膜的擊穿原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。染色體原位雜交生化鑒定：同功酶鑒定。 PEG法 脂質(zhì)體包裹融合移植 微注射 第四章 植物單倍體誘導及應用單倍體細胞的染色體數(shù)目只有二倍體的一半。 作為遺傳工程受體更為有效。在多年生植物中，幼年植株比老齡植株的花藥誘導頻率高。根據(jù)Sunderland,、Wicks和Norreel的研究，可以把早期的花粉發(fā)育分為三類：核融合——產(chǎn)生多倍體?！　　　　』ㄐ蛱幚恚?秋水仙素溶液中24～48h。培養(yǎng)基配制好后，將花粉按需要密度接種其中，置于恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)。預處理：花蕾低溫處理2－7天為宜，也可高溫、輻射、黑暗處理。 小麥、水稻和大麥的白化苗頻率較高，而玉米花粉植株中白化苗卻較少。 染色體結(jié)構(gòu)的變異可能是白化苗的成因。⒋胚珠或子房培養(yǎng)時可以發(fā)育成種子。Hanning早在1904年就培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚，發(fā)現(xiàn)離體胚可以充分發(fā)育，并且提前萌發(fā)形成小苗，這是世界上胚培養(yǎng)最早獲得成功的一例。在培養(yǎng)之前必須對所培養(yǎng)的對象在自然發(fā)育條件下的特性充分了解，比如胚的休眠問題、是否需要春花作用、胚萌發(fā)的溫度等。裸子植物的胚乳為配子體的一部分，由大孢子直接分裂發(fā)育而成，因此它屬于單倍體組織。 沼生目型胚乳 沼生目型胚乳是核型與細胞型之間的中間型。一些單基因控制的性狀不僅發(fā)生隱形突變，也發(fā)生顯性突變。在植物體內(nèi)，這些多倍性細胞在正常情況下不再發(fā)生分裂以維持正常分化細胞的功能，然而在離體培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中的激素以及培養(yǎng)環(huán)境，就有可能刺激這些多倍性細胞分裂，進而分化形成多倍體植株。在因培養(yǎng)類型引起的變異中，不僅有染色體倍性的異常變異，同時基因突變、染色體結(jié)構(gòu)變異、以及非DNA水平引起的變異亦相繼增加。 非正常有絲分裂 離體培養(yǎng)中，染色體除了整倍性變異外，還可觀察到大量的非整倍性變異，這種愈傷組織往往分化能力低下，再生植株大多生長不正常，有性繁殖遺傳穩(wěn)定差。DNA序列的選擇性擴增與丟失DNA序列的擴增與丟失也是體細胞無性系變異的原因之一。 在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，誘變劑可較均勻的接觸細胞，因此可以引起培養(yǎng)細胞相對較高頻率的發(fā)生突變，增加了選擇機會。 以細胞或原生質(zhì)體，則可以選擇X射線、紫外線等。目前采用這一途徑，已從多種植物中篩選出可利用的體細胞變異體。體細胞突變技術(shù)的不斷成熟，使多細胞生物大群體突變的建立成為可能。 不定芽增殖從現(xiàn)存的芽以外的任何器官、組織上通過器官發(fā)生重新形成的芽稱之為不定芽。一切通過其它增殖方式不能成功的植物，均可以通過此途徑獲得組培苗。一般在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月左右即可獲得健壯根系。與外植體類型有關，如頂芽最低，基部莖段次之，中部莖段最高。）。 人工種皮包被的繁殖體 一些體細胞胚、原球莖等不能過度干燥，但只需要用人工種皮包被即可維持良好的發(fā)芽狀態(tài)，如胡蘿卜體細胞胚。 微型變態(tài)器官繁殖體不能過度脫水，但亦需要適當干燥，除去表面及多余的水分，同時要進行表面消毒處理以繁殖包被后的感染。%%的CaCl2溶液中，經(jīng)20－。 液體狀態(tài)下便于細胞和營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換，細胞狀態(tài)可以相對保持一致，因此有利于在細胞水平上進行各種遺傳操作，生理生化活動的研究，同時為植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)提供了技術(shù)基礎。 一般來說，分散比較好的細胞懸浮物是由薄壁細胞組成的。選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素濃度；必要的附加物質(zhì)。接種細胞密度：接種初期的細胞密度過低往往使延遲期加長，～105個細胞/毫升，低于這一密度則會使細胞生長延遲；因此，通過饑餓法可以獲得處于G1和G2期的同步化細胞。Okamura等曾采用此途徑使胡蘿卜懸浮細胞較好的同步化。用平板培養(yǎng)的需要統(tǒng)計植板率，即每個平板接種細胞總數(shù)中形成細胞團的百分數(shù)。1單細胞培養(yǎng)方法細胞平板培養(yǎng) 所謂平板培養(yǎng)（plating culture）是指將一定密度的懸浮細胞接種到一薄層固體體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術(shù)。微室培養(yǎng)是細胞學研究的優(yōu)良實驗體系。 組織器官：由于天然產(chǎn)物一般為次生代謝產(chǎn)物，而植物次生代謝產(chǎn)物的積累具有組織器官特異性，因此，在起始細胞培養(yǎng)時應盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的器官、組織為外植體。 看護培養(yǎng) 看護培養(yǎng)（nurse culture）技術(shù)首先是有Muir等（1954）設計的，其操作方法是在固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長的愈傷組織，再在愈傷組織上放一小片濾紙，待濾紙濕潤后將細胞接種于濾紙上。獲得了細胞團以后繼續(xù)培養(yǎng)形成愈傷組織1．液體淺層培養(yǎng)：　　先將細胞制成一定密度的細胞懸浮液，用吸管將懸浮液移到培養(yǎng)皿中形成淺層，一般1mm左右，石蠟膜封口，靜置培養(yǎng)。 這種方法的優(yōu)點是操作簡單，不影響細胞活力。通過一定的理化措施可以使同一體系中的細胞達到相對同步化。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。懸浮培養(yǎng)對材料的要求 愈傷組織的要求：松散性好、增殖快、再生能力強。但是，這種理想狀態(tài)不容易得到。 新近試驗使用的二氧化硅化合物材料包括疏水的Tullanox和微親水的CabOSil，二者均可以粉末狀包裹在人工種子膠囊外層，操作時只需將膠囊在上述材料中滾動即可完成包被過程，操作簡單易行，大量生產(chǎn)還可以機械化操作。 同時，它最好能夠提供類似于胚乳的營養(yǎng)物質(zhì)，以供繁殖體發(fā)芽的需要。16. 體細胞胚規(guī)模化生產(chǎn)的要求作為人工種子繁殖體的體細胞胚，其基本要求是要具有發(fā)育上的同步性，還必需滿足如下標準特征： 其一，形態(tài)正常，具有完整的胚結(jié)構(gòu)；其二，與母體植物的基因型基本相同，特別是在重要經(jīng)濟性狀和農(nóng)藝性狀上沒有變異； 其三，具有較好的成熟性，能耐一定程度的脫水。早期的人工種子概念是：體細胞胚經(jīng)過人工種皮包被后而形成的體細胞種子。 芽的分生組織區(qū)也應存在與根尖分生組織同樣的情況。 與正常組織相比，葉綠素、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素含量較低，乙烯合成能力增強，過氧化物酶等活力增大。實際生產(chǎn)上只允許增殖培養(yǎng)基上于一定培養(yǎng)時間內(nèi)(繼代天數(shù)48周)形成4—5個芽作為其確切的繁殖系數(shù)。體細胞胚增殖增長率高，雙極性免去生根環(huán)節(jié)，但胚狀體休眠的誘導和解除還難以把握，其成苗率仍不高。跟常規(guī)的繁殖方法相比它是一種微型操作過程，因此，有時就直接稱之為微繁(micropropagation)。通過這些突變體研究，不僅建立了器官發(fā)育模式，而且分離鑒定了一大批與發(fā)育有關的基因，包括維持正常發(fā)育狀態(tài)的基因、促進發(fā)育進程的基因，以及相關修飾基因。 轉(zhuǎn)座子插入誘變轉(zhuǎn)座子插入誘變是近年來利用分子生物學技術(shù)發(fā)展起來的新的體細胞變異誘導方法。 其三，適當?shù)募毎愋鸵嗍求w細胞突變系篩選效率的重要條件。 體細胞無性系變異的誘導與選擇的優(yōu)點體細胞無性系變異的篩選有以下一些明顯的優(yōu)點： 可以在小空間內(nèi)對大量個體進行選擇。 堿基突變堿基突變是指DNA序列中堿基的改變。如果這種DNA重復復制多次發(fā)生，細胞內(nèi)DNA含量就會不斷上升。 培養(yǎng)基的物理狀態(tài)以及培養(yǎng)類型也會引起細胞的變異。供體植株原有的倍性水平在培養(yǎng)細胞多倍化過程中起著重要作用，處于二倍體水平上的細胞比處于單倍體水平上的細胞較為穩(wěn)定。 離體培養(yǎng)下變異特點 就單個變異體來講，離體培養(yǎng)中變異性狀往往是單一的，或少數(shù)幾個性狀的變異。游離核階段時間長短因植物不同而異。愈傷組織 在許多情況下，幼胚在離體培養(yǎng)中首先發(fā)生細胞增殖，形成愈傷組織。 幼胚剝離胚剝離的成功與否是幼胚培養(yǎng)成功與否的關鍵。⒊赤霉素打破休眠，常用于需后熟的種子萌發(fā)。在小麥花藥培養(yǎng)中12％的蔗糖比6～10％的蔗糖濃度有更高的綠苗率。 花粉白苗除外觀上缺乏綠色外，并無其它形態(tài)上的變異。 ?不同基因型對培養(yǎng)反應不同。 二是自然散粉法 這一方法可以和預培養(yǎng)結(jié)合進行，一般是將消毒后的花藥接種在液體培養(yǎng)基中，在一定的溫度條件下進行振蕩培養(yǎng)，讓花粉從花藥中自行散落到培養(yǎng)基中，再除去花藥壁等，將花粉重新培養(yǎng)在新鮮培養(yǎng)基上。自然加倍：發(fā)生頻率低，主要是由核內(nèi)有絲分裂產(chǎn)生的?！确至褳閮蓚€子細胞，以后不斷發(fā)育。 低溫處理的作用：可以激發(fā)花粉母細胞產(chǎn)生兩個相等核，而不是一個營養(yǎng)核一個生殖核；保持高比例的強生活力花粉，同時延緩體細胞組織的衰老；激發(fā)花粉產(chǎn)生原胚；促使細胞同步分裂。有時花粉培養(yǎng)也稱為小孢子培養(yǎng)(microspore culture)。2．單倍體植株的應用潛力迅速獲得純合型材料，縮短育種年限。分離過程必須快速并在低溫下進行，在分離和保存緩沖液中加入適量的鎂離子和甘油有利于核膜的完整性。融合方法融合參數(shù)，包括各種融合液都應選擇適當。 電融合法對稱融合（asymmetric fusion）－即兩個完整的細胞原生質(zhì)體融合。 供體細胞的分化程度 同一個基因型的植株生長在不同的環(huán)境條件下，它們的生理狀態(tài)會有改變。待小愈傷組織長至1mm左右時應及時轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上使其進一步生長。培養(yǎng)過程中，通過調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于其進一步的生長和發(fā)育。C左右融化與原生質(zhì)體混合而不影響原生質(zhì)體的 生命活動。 培養(yǎng)基注意調(diào)節(jié)常用滲透壓：常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。 葉片脫壁方法：酶包括纖維素酶、果膠酶處理，其濃度比例隨年齡和生理而變化。1986年，Spangenberg et 。核質(zhì)體：由原生質(zhì)膜和薄層細胞質(zhì)包圍細胞核形成的小原生質(zhì)體。 細胞分裂素對體細胞胚發(fā)育的影響研究報道較少，但幾乎所有的有關體細胞胚胎發(fā)生的培養(yǎng)基配方中，均有細胞分裂素的配合使用。由原生質(zhì)體產(chǎn)生胚狀體與器官發(fā)生形成個體的途徑相比，體細胞胚發(fā)育再生植株有兩個明顯的特點： 一是體細胞胚具有雙極性（doulble polarity）；有分化明顯的生物兩端，根端和芽端。 培養(yǎng)條件下，光照的作用更大程度上是調(diào)節(jié)細胞的分化狀態(tài)，而不是合成光合產(chǎn)物。外植體：種類及基因型，外植體供體植株及外植體本身生理生化特征，包括供體植株年齡、發(fā)育階段、生長環(huán)境、取材位置，外植體大小，外植體極性培養(yǎng)基成分：基本培養(yǎng)基，生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，其它成分環(huán)境條件：光，溫度總體上說，被子植物比裸子植物容易培養(yǎng)，在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培養(yǎng)成功的報道最多。 第一種過程是從愈傷組織生長中心器官原基 第二種過程中一是外植體中已存在器官原基，進一步培養(yǎng)即形成相應組織器官進而再生植株，如莖尖、根尖分生組織培養(yǎng)。如果先用生長素處理，后用細胞分裂素處理，則有利于細胞分裂而不利于細胞分化；反之，則有利于細胞分化。 愈傷組織內(nèi)的細胞并不是均一未分化的，即同一愈傷組織內(nèi)的細胞之間其狀態(tài)存在一定差異，特別是在組織器官培養(yǎng)時，往往出現(xiàn)部分細胞不完全脫分化的現(xiàn)象，從而使其很容易再分化再生植株，這對培養(yǎng)來說無疑是十分有利的。繼代培養(yǎng)：更換新鮮培養(yǎng)基來繁殖同種類型的材料（）。 即使對于植物細胞而言，細胞全能性也并不意味著任何細胞均可以直接產(chǎn)生植物個體。通常1～2個大氣壓可促進植物組織生長，2個大氣壓以上時，出現(xiàn)生長障礙，6個大氣壓時植物組織即無法生存。溫度。再用消毒劑消毒。 在不影響培養(yǎng)目的的前提下盡可能選擇自然繁殖器官作外植體；一、二年生草本植物的離體培養(yǎng)比多年生植物容易；生長季節(jié)和營養(yǎng)生長階段生長啟動快、分化快。水水既是培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的溶劑，又是培養(yǎng)基的重要組成部分，它占培養(yǎng)基成分的95％。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學儀器不受潮濕和灰塵污染。要求寬敞明亮，通風條件好。倍性育種：通過胚乳培養(yǎng)獲得三倍體；通過花粉和花藥培養(yǎng)進行單倍體育種。1962年Marshing和Shong發(fā)明了MS培養(yǎng)基.通過細胞工程可以生產(chǎn)有用的生物產(chǎn)品或培養(yǎng)有價值的植株，并可以產(chǎn)生新的物種或品系。（廣義）又叫離體培養(yǎng)，原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。獲取脫毒苗。第一篇 植物細胞工程第一章 實驗基