擬南芥基因克隆的策略與途徑-文庫(kù)吧在線(xiàn)文庫(kù)
【正文】 傳連鎖分析或染色體異常將基因佇到染色體的1個(gè)具體位置的基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建高密度的分子連鎖圖，找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，不斷縮小候選區(qū)域進(jìn)而克隆該基因，并闡明其功能和生化機(jī)制。這些數(shù)據(jù)被儲(chǔ)存在專(zhuān)門(mén)的數(shù)據(jù)庫(kù)中（表1）（Lukowitz等， 2000）。另外，一種更為有效的方法衍生的CAPS（dCAPS）（Nam等， 1989； Michaels 和 Amasino， 1998）可把任何已知的點(diǎn)突變作為分子標(biāo)記，只要在PCR是引入不配對(duì)的引物，使擴(kuò)增的序列在一個(gè)生態(tài)型中具有限制性酶切位點(diǎn)，而在另一生態(tài)型中沒(méi)有，以形成多態(tài)性。然后播種F1代種子。起先用分布于擬南芥五條染色體上的25個(gè)標(biāo)記（相鄰的兩個(gè)標(biāo)記之間大約相距20 cM）進(jìn)行分析，確定突變基因是和哪個(gè)或者哪幾個(gè)標(biāo)記是連鎖的，然后用三點(diǎn)測(cè)交的方法來(lái)定義一個(gè)包含突變基因的大約20 cM的遺傳間隔。但是這往往要冒因?yàn)樽鲌D群體不夠大再一次種植F2代植物而延長(zhǎng)整個(gè)作圖過(guò)程的時(shí)間的風(fēng)險(xiǎn)。利用新興的RNA干擾（RNAi）也可有效地確定目的基因。1984年，用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法首先在玉米中分離了bronze基因，該基因編碼了玉米花色素合成途徑的關(guān)鍵酶——UDP葡萄糖類(lèi)黃3O葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶〔2〕。 克隆轉(zhuǎn)座子主要有兩條途徑：其一，利用抗體識(shí)別或cDNA探針從野生型植株中獲得表達(dá)量降低或不穩(wěn)定基因座的序列，再?gòu)耐蛔凅w中分離得到相應(yīng)的轉(zhuǎn)座子：其二是根據(jù)序列同源性，在基因組的不同位置分離同一家族的轉(zhuǎn)座子成員。根據(jù)轉(zhuǎn)座的自主性，這類(lèi)元件又可以分為自主轉(zhuǎn)座元件和非自主轉(zhuǎn)座元件，前者本身能夠編碼轉(zhuǎn)座酶而進(jìn)行轉(zhuǎn)座，后者則需在自主元件存在時(shí)方可轉(zhuǎn)座，以玉米的Ac/Ds體系為例，Ac(Activator)屬于自主元件，Ds(Dissociation)則是非自主元件，必需在A(yíng)c元件存在下才能轉(zhuǎn)座〔1〕。1951年Barbara Mclintock首先在玉米中發(fā)現(xiàn)了控制元件，后來(lái)命名為轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子(transposon)。將這些片段測(cè)序后拼接起來(lái)以得到整個(gè)40 Kb的序列，然后將它與野生型植物（Col0或者Ler）的序列進(jìn)行比對(duì)，這就可以找到這個(gè)區(qū)域中的多個(gè)基因。最終目標(biāo)是將包含突變基因的遺傳間隔縮小到40 Kb甚至更?。?cM）。當(dāng)然也有必要確認(rèn)原來(lái)的生態(tài)型背景。圖2例舉了一種高效的擬南芥圖位克隆方法。迄今為止，已有幾十種技術(shù)可用于分子標(biāo)記的篩選（Wang等，2000）。 目前完成整個(gè)擬南芥的圖位克隆過(guò)程大約需要一年時(shí)間。不論要揭示某個(gè)基因的功能,還是要改變某個(gè)基因的功能,都必須首先將所要研究的基因克隆出來(lái)。特定基因的克隆是整個(gè)基因工程或分子生物學(xué)的起點(diǎn)。在這個(gè)過(guò)程中，我們從篩選突變體開(kāi)始，逐漸找到和表型相關(guān)的基因。其中最為常用的是簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性（SSLPs）和單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。從基于Col0和Ler遺傳背景的突變體出發(fā)，我們有可能在大約一年時(shí)間內(nèi)找出與這個(gè)突變相關(guān)的基因，這其中
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