【正文】 7) 加入1TAE電泳緩沖液至電泳槽中，液面高于膠面1mm，小心取出梳子。以無DNA的TE為空白，測(cè)定樣品在260nm和280nm波長下的光密度吸收值，每個(gè)樣品重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在擴(kuò)增產(chǎn)物的3末端加上A，得到的DNA序列為鈍端，因此，需要在回收純化后進(jìn)行加A的過程，通常是以PCR回收產(chǎn)物為模板，加上一定量的普通Taq酶和反應(yīng)液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分鐘，然后將加A產(chǎn)物直接用于TA連接。本制品是以最為常用的pUC18載體為基礎(chǔ)研制而成，所以它具有同pUC18載體完全相同的功能。由α互補(bǔ)形成的具有功能活性的β半乳糖苷酶,可以用Xgal顯色測(cè)定出來，它能將無色的化合物Xgal切割成半乳糖和藍(lán)色底物。2. 16℃反應(yīng)30分鐘 (過夜反應(yīng)也不影響連接效率)。3. 克隆時(shí)使用的Insert DNA片段 (PCR 產(chǎn)物) 盡量進(jìn)行切膠回收純化，PCR產(chǎn)物中的短片段DNA(甚至是電泳也無法確認(rèn)的非特異性小片段)、殘存引物等雜質(zhì)都會(huì)影響TA克隆的效率。3. DNA片段的立體結(jié)構(gòu)、DNA片段的長短都會(huì)影響克隆效率。5. 確認(rèn)抗生素的濃度是否過大。 通過化學(xué)方法，可人工誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)，最經(jīng)典的是CaCl2法（1972年），其原理是細(xì)菌處于0℃、CaCl2低滲液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA與鈣離子結(jié)合形成抗DNase的羥基鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物；通過在豐富培養(yǎng)基中恢復(fù)1h左右，球狀細(xì)胞復(fù)原，轉(zhuǎn)化子中的抗性基因得以表達(dá)；隨后將菌液涂布于含抗生素的選擇性培養(yǎng)基平板上，轉(zhuǎn)化子可分裂、增殖，形成菌落。同時(shí)，開環(huán)狀質(zhì)粒只有超螺旋質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率的75％，線型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率更要低100～1000倍，線型轉(zhuǎn)化率低是因菌體中核酸外切酶將進(jìn)入的線型DNA降解的原因。 6．含抗生素LB平板 配方同上，高壓消毒后，冷卻至65℃左右，加入氨芐青霉素，終濃度為50～100μg／m1培養(yǎng)液，加入抗生素后立即倒平板。 8．42℃熱沖擊90s后，立即放入冰浴,放置2－5分鐘。 2．制備感受態(tài)細(xì)胞的全部操作均須于冰浴低溫操作，同時(shí)注意無菌操作，防止感受態(tài)細(xì)胞受雜菌污染。兩個(gè)引物分別位于靶序列的兩端，同兩條模板的3＇端互補(bǔ)，由此限定擴(kuò)增片段。這是因?yàn)槿绻嘶饻囟鹊陀诿傅淖钸m反應(yīng)溫度時(shí)，酶的合成反應(yīng)會(huì)非常緩慢，但片面考慮提高溫度又會(huì)造成引物脫落而不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如上所述，Tm值的估計(jì)可簡單地根據(jù)經(jīng)驗(yàn)式Tm＝4GC+2AT+℃獲得。一般引物自身配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對(duì)數(shù)不大于3，兩條引物間配對(duì)堿基數(shù)小于5個(gè)。 (2)dNTP：常用dNTP濃度為20μmol／L(可用范圍為20～200μmol／L)。 (5)保護(hù)劑：由于PCR反應(yīng)體系中蛋白的含量極低，所以加人的酶非常容易變性，通常需加入一定量的保護(hù)劑。3．引物濃度 ～／L。94℃變性3min，94℃45秒，64℃ 1分鐘，72℃3分鐘，20個(gè)循環(huán)?；厥諏?shí)驗(yàn)中兩個(gè)最重要的技術(shù)指標(biāo)是產(chǎn)物的純度與回收率：純度未達(dá)標(biāo)時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響以后的酶切、連接、標(biāo)記等酶參與的反應(yīng)；回收率不理想時(shí)往往會(huì)大大增加前期工作量。離心收集玻璃粉后加入TE并于37℃保溫，洗脫吸附于玻璃粉上DNA，再次離心收集含DNA的上清液即可。該系統(tǒng)不僅用于純化PCR產(chǎn)物，還可以從反應(yīng)液或普通瓊脂糖凝膠中回收各種類型的DNA片段，適用范圍從150bp到十幾kb。 5. ，開蓋放置2~3分鐘，務(wù)必使乙醇充分揮發(fā)干凈，加入40181。2 室溫低于25℃時(shí)，純化樹脂 （于GS結(jié)合液中）可能出現(xiàn)結(jié)晶或鹽析，此時(shí)請(qǐng)務(wù)必預(yù)熱，使其完全溶解后使用。由于每一循環(huán)的產(chǎn)物都可作為下一循環(huán)反應(yīng)的模板，因此擴(kuò)增產(chǎn)物的量以指數(shù)級(jí)方式增加。ddH2012μl10PCR Buffer（無Mg離子）2μl25mM Mg離子dNTP(10mM each)Primer l(20μM)Primer 2(20μM)模板DNA TaqDNA聚合酶（） 2μl1μl總體積 20μl5混勻，短暫離心． 6放在PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)九 限制性內(nèi)切酶酶切法鑒定重組質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握單、雙酶切的技術(shù)，理解酶切法進(jìn)行重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定的原理。終止酶切反應(yīng)時(shí)，大多數(shù)可在65℃水浴中，保溫10min，就可使大部分酶失活。同時(shí)還要考慮到DNA每經(jīng)一步處理，就得重新純化，這樣DNA濃度的損失量幾乎達(dá)到50％。當(dāng)使用的限制酶活性不高時(shí)，必須加大限制酶的用量。目前，各試劑商都提供了雙酶切緩沖液或通用緩沖液，可以根據(jù)說明書進(jìn)行操作。(6)10mg／ml溴乙錠溶液。 (5)分別加入EcoR I；BamH I酶和EcoR I+ BamH I酶。(12) 將瓊脂糖溶液倒人模具，～，檢查有無氣泡。電壓選擇為3～5V／cm。實(shí)驗(yàn)原理將外源基因克隆在含有l(wèi)ac 啟動(dòng)子的表達(dá)載體中，讓其在大腸桿菌中表達(dá)。采用考馬斯亮藍(lán)快速染色，可及時(shí)觀察電泳分離效果。工作液5貯存液Tris堿25 mmol／LTris堿甘氨酸250mmol／L (pH )甘氨酸94gSDS％1％SDS50ml加ddH2O 至1000ml樣品處理液Deionized water ml M TrisHCl, pH mlGlycerol ml10% (w/v) SDS ml2mercaptoethanol ml1% (w/v) bromophenol blue ml染色液 ％考馬斯亮藍(lán)—R250染色液。6 用1ml 10mM TrisHCl（）懸浮細(xì)菌，5000rpm離心1分鐘，收集細(xì)菌。結(jié)果： 誘導(dǎo)的pETB1菌液樣品在分子量61kDa處有一明顯的深厚條帶，而其他三種處理沒有此條帶。 4．分離小分子肽時(shí)，分離膠的濃度可提高到20％～25％。實(shí)驗(yàn)原理 Trizol是一種酚與異硫氰胍的混合物，非常容易把組織和細(xì)胞中的總RNA提取出來。吸掉上清，空氣干燥RNA沉淀10分鐘，加入適量的DEPC處理水溶解RNA，立即電泳和紫外濃度和純度鑒定，剩余20℃保存?zhèn)溆?。于室溫放?0分鐘或更長時(shí)間，使凝膠凝固。紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度和純度總RNA用10mM的TrisHCl()稀釋，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260和A280值，根據(jù)1OD=40ug定量,并計(jì)算A260/A280比值，每一樣品重復(fù)3次。玻璃制品應(yīng)于200℃烘烤過夜， NaOH，1mM EDTA作徹底沖洗，再用無RNase水沖洗。再通過基因的特異引物PCR擴(kuò)增得到基因的特異片段，此方法稱為2步法。操作步驟1總RNA的提取根據(jù)上次實(shí)驗(yàn)總RNA的提取進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)原理在基因分析的雜交方法中幾乎都用到同位素或非同位素標(biāo)記的探針。4反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液 (5 –10ul) 進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)RTPCR反應(yīng)產(chǎn)物。本試劑盒中含有進(jìn)行One Step法RTPCR反應(yīng)用的全部試劑，可以簡便而有效地對(duì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增分析。雖然原理上PCR法是擴(kuò)增DNA，RNA不能直接被擴(kuò)增，但是經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄酶的作用把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，PCR法便可應(yīng)用于RNA的解析了。這些試劑都要反復(fù)使用，所以開啟和關(guān)閉試劑瓶一定防止污染。將凝膠浸入1甲醛凝膠電泳緩沖液中，34V／cm電壓降進(jìn)行電泳。光照或高壓后溶液逐漸變黃，淡黃色的緩沖液可正常使用，而深黃色緩沖液則不然。操作步驟總RNA的提取1小鼠肝組織的勻漿裂解斷頸處死小鼠，立即解剖取出肝臟，取50100mg到玻璃勻漿器中，假如1mlTrizol反復(fù)勻漿膜碎組織，使細(xì)胞完全裂解。3. 室溫較低時(shí)膠液不易凝固，可以在槽中加370C溫水。299 4．為防止相鄰泳道樣品的擴(kuò)散，而導(dǎo)致電泳條帶的不整齊，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1SDS樣品緩沖液。10 渠5ul測(cè)定蛋白濃度。3 取2ml培養(yǎng)菌加入到48ml培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=。10％SDS。蛋白質(zhì)在強(qiáng)陰離子去污劑SDS與某一還原劑(如二巰基乙醇)共同作用下并加熱使蛋白質(zhì)解離后，變性的蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合并因此而帶負(fù)電荷，不同的蛋白質(zhì)結(jié)合SDS的量僅與分子量成正比而與氨基酸的序列無關(guān)，在SDSPAGE電泳時(shí)，蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺中的遷移率僅僅取決于蛋白質(zhì)的分子量。2. ，否則，甘油濃度過高會(huì)抑制酶活性。(15) 加入1TAE電泳緩沖液至電泳槽中，液面高于膠面1mm，小心取出梳子。 (8)加入3μl 10溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻后進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，成像觀察。器材(1)恒溫水浴(2)電泳槽(3)電泳儀(4)電爐(5)紫外線檢測(cè)儀(6)移液器； 10100μl,實(shí)驗(yàn)步驟 酶切 (1)設(shè)計(jì)單酶切反應(yīng)和雙酶切反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容試劑與器材試劑(1)10酶切緩沖液(購酶時(shí)隨附)(2)EcoRⅠ酶；BamH I酶。為此，也不得不放大反應(yīng)體積或者將DNA重新濃縮。7酶解的體積，～，控制反應(yīng)體積為15～20μl。少數(shù)較耐熱的酶，至終濃度為10mmol／L。因此生產(chǎn)廠商在銷售酶的同時(shí)往往附帶專門的緩沖液。紫外觀察，必要時(shí)拍照。2．試劑（1）50TAE電泳緩沖液（2）10PCR緩沖液：（3）4種dNTP混和液10mmol/L（4）Pfu DNA聚合酶（5U/μl）（5）引物（20μM）（6）10溴酚藍(lán)上樣緩沖液方法和步驟1 取培養(yǎng)過夜的轉(zhuǎn)化菌液20μl，沸水浴35分鐘。在分子生物學(xué)研究中，廣泛地應(yīng)用于研究基因突變，獲取加上酶切位點(diǎn)的目的基因和DNA序列測(cè)定等方面，也可以用來鑒定重組載體，是分子生物學(xué)中一項(xiàng)極為常用的技術(shù)。 6. 離心管中的液體即是純化的DNA片段，取4181。 4 其他試劑盒，本實(shí)驗(yàn)采用的是北京塞百盛生物技術(shù)公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒。割下的膠加入TE后于65℃保溫促使凝膠熔化，再加入等體積的酚抽提去除凝膠。注意事項(xiàng)，因此，在進(jìn)行PCR前，模板的純化和引物設(shè)計(jì)尤為重要。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容儀器和試劑1．儀器 PCR儀，微型水平電泳槽，電泳儀等。模板可以是基因組DNA或純化的質(zhì)粒DNA，當(dāng)然兩者的DNA量在PCR起始模板中相差很大。 (3)K+離子濃度：PCR反應(yīng)中K+離子的作用是促進(jìn)Taq酶活力與促進(jìn)引物退火，一般使用濃度是50mmol／L，但當(dāng)K+離子濃度高于50mmol／L時(shí)會(huì)抑制Taq酶活力。 (二)PCR反應(yīng)條件 1．PCR緩沖液 常用的1PCR緩沖液為10mmol／L TrisHCl (常溫)，50mmol／L KCl，／L MgCl2?？偠灾?，引物的3′末端不要考慮使用T。引物過長時(shí)又會(huì)造成Tm值過高，超過酶的最適反應(yīng)溫度，還使合成引物的費(fèi)用大大增加。 (一)PCR引物設(shè)計(jì) 1．Tm值 Tm值是PCR引物設(shè)計(jì)中的一個(gè)重要參數(shù)，是指引物與模板之間精確互補(bǔ)并且在模板過量的情況下有50％的引物與模板配對(duì)，而另外50％的引物處于解離狀態(tài)時(shí)的溫度，Tm值一般高于55℃。【思考題】？如何提高轉(zhuǎn)化率？？ 實(shí)驗(yàn)六 PCR擴(kuò)增基因特異片段實(shí)驗(yàn)?zāi)康模? 學(xué)習(xí)PCR體外擴(kuò)增的原理及其引物設(shè)計(jì)原則；了解擴(kuò)增過程中各因素對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響；掌握PCR的基本操作。以上操作均需在無菌條件下進(jìn)行。 3． ，接種于50 ml新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)OD600=；4℃10min,然后4℃ 4000r／min離心8min，棄去上清液。 2．重組質(zhì)粒 pNTEGFP。轉(zhuǎn)化時(shí)菌濃度應(yīng)控制在不超過107／ml。因此，用于pUC18載體測(cè)序的引物都可以使用。有些DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物是平端, 如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005) 等擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物不能直接用于TA克隆；PCR產(chǎn)物保存時(shí)間不要過長, 長時(shí)間保存的PCR產(chǎn)物會(huì)脫去末端的A堿基。6. 連接效率偏低時(shí)，可適當(dāng)延長連接時(shí)間至數(shù)小時(shí)。5. 挑選白色菌落，使用PCR法確認(rèn)T載體中插入片段的長度大小。 200mg/ml的IPTG 過濾除菌 20mg/ml的X—gal 溶于二甲基甲酰胺，避光保存。對(duì)克隆后的PCR產(chǎn)物用M13 Primers進(jìn)行DNA測(cè)序。在pUC18載體的多克隆位點(diǎn)處的Xba I 和Sal I 識(shí)別位點(diǎn)之間插入了EcoR V 識(shí)別位點(diǎn)，用EcoR V 進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的339。106 Dalton1 OD260nm=40mgRNA10kb=180。電壓選擇為3～5V／cm。(4) 將瓊脂糖溶液倒人模具，～，檢查有無氣泡。(2)瓊脂糖。指示劑一般加在電泳上樣緩沖液中，為了使樣品能沉人膠孔，還要加入適量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。(4)緩沖液離子強(qiáng)度：緩沖液是電泳場(chǎng)中的導(dǎo)體，它的種類、pH值、離子濃度直接影響電泳的效率。通過這兩種介質(zhì)的濃度變化調(diào)整所形成凝膠的分子篩網(wǎng)孔大小，分離不同分子量的核酸片段。 1．影響泳動(dòng)的四大因素 (1)影響泳動(dòng)的首要因素是電泳樣品的物理性質(zhì)：包括電荷多少、分子大小、顆粒形狀和空間結(jié)構(gòu)。【思考題】堿法提取質(zhì)粒的原理是什么？【課外閱讀】高純度質(zhì)粒DNA的提取,參閱Qiagen公司說明書,網(wǎng)站:實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的電泳和純度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆誅NA瓊脂糖電泳技術(shù)，了解紫外分光光度法測(cè)定DNA濃度和純