【正文】 的使用方法：（1）將熒光顯微鏡置暗室，開啟光源，待光源穩(wěn)定并達(dá)到一定亮度（約5~10min）后，對(duì)準(zhǔn)光軸。4．熟悉細(xì)菌的特殊染色法。（2）化學(xué)學(xué)說：革蘭陽性菌含有大量的核糖核酸鎂鹽，與進(jìn)入胞漿內(nèi)的結(jié)晶紫和碘牢固結(jié)合成大分子復(fù)合物，不易被95%酒精脫色；而革蘭陰性菌含此種物質(zhì)少，故易被乙醇脫色。（4）染色：分以下四步：1min，水洗 1min，水洗 ，水洗 ，水洗結(jié)晶紫 盧戈碘液 95％乙醇 稀釋石炭酸復(fù)紅 待干、鏡檢（初染） （媒染） （脫色） （復(fù)染）3．結(jié)果：革蘭陽性菌染成紫色；革蘭陰性菌染成紅色。三、特殊染色法細(xì)菌的細(xì)胞壁、核質(zhì)、胞漿顆粒和細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)如芽胞、莢膜、鞭毛等，必須用相應(yīng)的特殊染色法才能染上顏色。若水滴向周圍流散而不形成水珠表示玻片處理良好。（2）染色：分為以下三步。結(jié)果：菌體及背景均染成紫色，莢膜染成淡紫色或無色。四、不染色標(biāo)本檢查法細(xì)菌未經(jīng)過染色呈無色透明，在顯微鏡下為有折光性的小點(diǎn)，不能判斷細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征。觀察要點(diǎn)：有鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)活潑，可向不同方向迅速運(yùn)動(dòng)，位置移動(dòng)明顯。因此，微生物實(shí)驗(yàn)所用的各種玻璃器材必須清洗干凈后才能使用。若用上述方法不能洗凈，可再置清潔液中浸泡數(shù)小時(shí)（針頭不能用清潔液泡），取出用自來水沖洗7次以上，干燥后備用。注意：任何已滅菌的器材。（2）溶化：將調(diào)配好的混合物置電爐上隔水加熱，使其完全溶解，注意隨時(shí)攪拌，防止溶液外溢，溶解完畢，應(yīng)補(bǔ)足失去的水分。在培養(yǎng)基中加入NaOH后需再測(cè)一次PH，如仍未達(dá)到所需PH，再按上述方法進(jìn)行矯正。4）瓊脂高層培養(yǎng)基：分裝于試管，量為試管高度的2/3，滅菌后趁熱將試管直立凝固。2）效果檢驗(yàn)：將已知菌種接種于培養(yǎng)基上，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況、生化反應(yīng)等是否符合?！窘Y(jié)果記錄和報(bào)告】實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌的接種培養(yǎng)法與生長(zhǎng)現(xiàn)象的觀察【目的和要求】1．掌握無菌技術(shù)，建立無菌觀念；明確無菌操作時(shí)注意要點(diǎn)。目前實(shí)驗(yàn)室常用的是經(jīng)濟(jì)實(shí)用的300~500W電熱鎳鉻絲。方法：（圖42）（1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許細(xì)菌。（4）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。圖44 固體培養(yǎng)基連續(xù)劃線法（2）分區(qū)劃線法（圖45）1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。（3）試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。（1）方法：1）將標(biāo)本用無菌生理鹽水稀釋成不同濃度：10101010105等。角，劃線要密而不重復(fù)，充分利用培養(yǎng)基，并注意不能劃破平板。2．CO2培養(yǎng)法（1）CO2孵育箱：能自動(dòng)調(diào)節(jié)箱內(nèi)CO2的濃度和溫度，使用方便。4．厭氧培養(yǎng)法：（1）厭氧罐培養(yǎng)法：用理化方法使容器內(nèi)形成無氧環(huán)境，用于專性厭氧菌培養(yǎng)。袋中裝有催化劑鈀粒和2支安瓿，分別裝有HCO2發(fā)生器（化學(xué)藥品，成分同上）、指示劑美藍(lán)。箱側(cè)有一交換室，具有內(nèi)外二門，內(nèi)門通箱內(nèi)先關(guān)著。（2）有鞭毛的細(xì)菌：沿穿刺線向四周擴(kuò)散生長(zhǎng)，穿刺線邊緣呈羽毛狀，周圍培養(yǎng)基變渾濁（如大腸埃希菌）。2．掌握常用生化反應(yīng)的原理和方法。細(xì)菌的生化反應(yīng)很多，本次實(shí)驗(yàn)著重介紹一些最常用、最基本的試驗(yàn)，其余部分可參見附錄。2）將其中的葡萄糖換成其他的糖（或醇），就可以做成其他糖（或醇）的發(fā)酵管。 臨床應(yīng)用：該試驗(yàn)主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別，前者為陽性，后者為陰性。（2）方法：1）將細(xì)菌種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)24~48h。臨床應(yīng)用：常用于腸桿菌科屬間的鑒別，沙門菌屬（甲型副傷寒沙門菌除外）、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等多為陽性，其他菌屬為陰性?！　　　　　　　　　　　　　∮|酶H２Ｏ２　→　H２O＋［Ｏ］２［Ｏ］→ Ｏ２　↑ （2）方法：方法1：取3%，或加入到不含血液的肉湯培養(yǎng)物中，立即觀察結(jié)果。方法2：濾紙法，取潔凈濾紙一小塊，沾取菌落或菌苔少許，然后滴加試劑于其上。、工作原理、使用方法、注意事項(xiàng)和應(yīng)用。2．水中細(xì)菌檢查 （1）方法：1）用無菌三角燒瓶以無菌的方法采集水樣（自來水、河水均可）。2）接種 以無菌方法用棉簽在瓊脂平板的一角(1/4處)來回劃線，去掉棉拭，然后用接種環(huán)在原劃線上過2~3下，接著往下劃線分離。（2）取上述接種大腸桿菌和枯草桿菌的肉湯各一管，放于100℃水浴中，加熱煮沸，維持5min，取出置冷水中冷卻，做好標(biāo)記。（3）注意事項(xiàng)：1）滅菌時(shí)溫度不能超過180℃，否則布料、紙張等易起火燃燒。（2）使用方法（以電熱直立式高壓滅菌器為例）：1）準(zhǔn)備：向鍋內(nèi)加水至水位線為止。（3）注意事項(xiàng)：1）每次滅菌前應(yīng)檢查滅菌器是否處于良好的工作狀態(tài), 尤其是安全閥是否良好。7）定期檢查滅菌效果。若變?yōu)辄S色混濁，說芽胞未被殺滅，滅菌失敗。（3）結(jié)果：A和B平板除了紙片和玻璃遮住的部分有細(xì)菌生長(zhǎng)以外，其它地方都無菌生長(zhǎng)；C平板不長(zhǎng)菌?！驹噭┡c器材】1．培養(yǎng)基：一般需氧和兼性厭氧菌采用水解酪蛋白（MH）瓊脂或MH液體培養(yǎng)基（~）。有效期為6個(gè)月。（3）細(xì)菌接種：用無菌棉拭蘸取已調(diào)試的菌液，在管壁上稍加擠壓之后，手持棉拭于MH瓊脂表面均勻劃線接種，共劃3次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60176。購買培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)考慮其質(zhì)量，對(duì)每批MH瓊脂平板均需用標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測(cè)，合格后方可使用。（4）培養(yǎng)溫度以35℃為宜。二、 試管稀釋法 1．原理將待測(cè)細(xì)菌種于一系列含有不同濃度抗菌藥物的液體培養(yǎng)基中，定量測(cè)定抗菌藥物抑制或殺死該菌的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）或最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration,MBC）。3．結(jié)果判斷及報(bào)告將試管拿出逐一對(duì)光觀察，凡無肉眼可見細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度即為對(duì)待測(cè)菌的最低抑菌濃度（MIC）。（4）結(jié)果應(yīng)在12~18h內(nèi)觀察，培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，被輕度抑制的部分細(xì)菌可能會(huì)重新生長(zhǎng)，由于某些抗菌藥物不夠穩(wěn)定，時(shí)間長(zhǎng)了其抗菌活性也會(huì)降低，甚至消失，從而使MIC增高。當(dāng)其他PBPs被β－內(nèi)酰胺類抗生素抑制而不能發(fā)揮作用時(shí)，PBP2α可替代它們完成細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，從而使細(xì)菌得以生存。（4）注意事項(xiàng)：1）頭孢西丁法結(jié)果觀察時(shí)應(yīng)使用反射光線。（1）篩選試驗(yàn)（紙片擴(kuò)散法）1）藥物紙片：頭孢泊肟(Cefprozil,CPD)10μg/片 或頭孢他啶(Ceftazidime,CAZ) 30μg/片 或氨曲南(Aztreonam,ATM) 30μg/片 或頭孢噻肟(Cefotaxime,CTX) 30μg/片 或頭孢曲松(Ceftriaxone,CRO) 30μg/片） 2）方法：，稍干后，在瓊脂培養(yǎng)基表面貼上頭孢他啶等藥物紙片（同KB法），之后放35℃溫箱中培養(yǎng)1618h觀察結(jié)果。自1983年德國首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道以來，在全世界ESBLs檢出率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)。由于頭孢西丁和苯唑西林較甲氧西林穩(wěn)定，不易失活，通常使用這兩種藥物代替甲氧西林測(cè)定葡萄球菌的耐藥性。目前臨床的自動(dòng)化或半自動(dòng)化的藥敏試驗(yàn)多采用與次類似的微量稀釋法。（2）抗菌藥物必須使用標(biāo)準(zhǔn)粉劑，不應(yīng)使用口服藥而影響其含量。（3）試驗(yàn)方法：1）排列試管：取無菌試管10~15支排列于試管架上，除第一管外，其余每管加入MH液體培養(yǎng)基1ml。5．質(zhì)量控制：以新鮮傳代的金黃色葡萄球菌ATCC2592大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853等標(biāo)準(zhǔn)菌株在相同條件下用與常規(guī)試驗(yàn)相同的方法測(cè)定對(duì)同種抗菌藥物的敏感性，標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌環(huán)應(yīng)在預(yù)期的范圍內(nèi)。長(zhǎng)期儲(chǔ)存須置20℃的冰箱，日常使用或沒用完的紙片應(yīng)及時(shí)放4℃保存，用時(shí)須提前1~2 h取出放室溫平衡。紙片一旦接觸瓊脂表面，就不能再移動(dòng)。KB法是由Kirby Bauer 建立，美國NCCLS推薦，目前為世界所公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法（定性法）。不同種類的待測(cè)菌藥敏試驗(yàn)選擇不同的抗菌藥物，藥敏紙片的選擇見表71。（5）適用范圍：因紫外線的穿透力差，故只使用于空氣和物體表面的消毒。（2）試驗(yàn)方法：1）取A、B、C 3個(gè)普通平板，分別將葡萄球菌劃線接種于平板上。③生物學(xué)指示法：是高壓蒸汽滅菌中檢測(cè)效果中最可靠的一種方法。4）加熱過程中，注意其壓力表指針勿超過警戒線。打開放氣閥，排凈鍋內(nèi)冷空氣，直到壓力表降回到“0”時(shí)，關(guān)閉氣閥，再繼續(xù)加熱。兩桶底部之間的空隙用來盛水，通過里面的電熱管使水加熱（或直接用明火對(duì)鍋底加熱）。由底部的電爐絲（或電熱器）加熱，并通過箱內(nèi)的感溫管和溫度控制器自動(dòng)控制和保持所需溫度。（2）伸出任一手指在“消毒前”的培養(yǎng)基表面輕輕按一下，%碘酊、75%酒精做皮膚消毒（注意皮膚消毒方法）待干后，再在“消毒后”的培養(yǎng)基上輕輕一按。（2）結(jié)果觀察報(bào)告：取出平板，對(duì)光觀察其上有無菌落形成，并計(jì)數(shù)平板上的菌落，紀(jì)錄結(jié)果，以每毫升水中的菌落數(shù)（或CFU/ml）報(bào)告之。3．菌種：大腸桿菌、枯草桿菌、葡萄球菌。臨床應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的鑒別，前者為陰性，后者為陽性。也可用于其他細(xì)菌的鑒別。3．結(jié)果觀察：在24~48h內(nèi)如果培養(yǎng)基變深藍(lán)色有細(xì)菌生長(zhǎng)為陽性。臨床應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒別。2）取出，%，放48~50℃水浴2h（或37℃4h），充分搖動(dòng)后，觀察結(jié)果。2．甲基紅試驗(yàn)（MR試驗(yàn)）（1）原理：某些細(xì)菌如大腸桿菌能將葡萄糖分解成丙酮酸，并進(jìn)一步將丙酮酸分解成大量有機(jī)酸（甲酸、乙酸、乳酸等），加入甲基紅指示劑后顯紅色為試驗(yàn)陽性。（2）方法： 1）葡萄糖發(fā)酵管的制備：取經(jīng)高壓滅菌并經(jīng)加熱融化的半固體瓊脂100ml，以無菌操作加入經(jīng)煮沸消毒的20%葡萄糖水溶液5ml、1%，混勻之后，趁熱倒入小試管并冷卻凝固。3．試劑：甲基紅試劑、40%KOH、靛基質(zhì)試劑、3%H2O1％鹽酸四甲基對(duì)苯二胺（或1％鹽酸二甲基對(duì)苯二胺）。不同細(xì)菌菌落的形態(tài)學(xué)特征不同，可以鑒別細(xì)菌。該法適于作厭氧菌的大量培養(yǎng)研究。（5）庖肉培養(yǎng)基法：將庖肉培養(yǎng)基上面的石蠟熔化，用毛細(xì)管吸取標(biāo)本后接種于培養(yǎng)基中，待石蠟?zāi)毯笾?7℃孵育。每次觀察標(biāo)本后需重新抽氣換氣，用過的鈀粒經(jīng)160℃2h干烤后可重復(fù)使用。（見圖47）圖47 燭缸法（3）化學(xué)法（重碳酸鈉鹽酸法）：，分別將二種試劑置于容器內(nèi)，將容器放置在標(biāo)本缸中，密封后傾斜容器，使二種試劑接觸混合產(chǎn)生CO2。發(fā)生有菌材料污染應(yīng)及時(shí)進(jìn)行消毒處理。（2）所有操作均需在酒精燈火焰附近進(jìn)行，平皿蓋、試管塞、瓶塞均應(yīng)拿在手上打開（具體見前述），禁止將蓋或塞事先取下放置在桌面上。（2）直接涂布法：多用于紙片法和管碟法藥敏試驗(yàn)。4）在平板底上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。角，將已挑取細(xì)菌的接種環(huán)先在平板一側(cè)邊緣均勻涂布，然后運(yùn)用腕力將接種環(huán)在平板上自上而下，來回劃線。（5）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。2．L形玻棒：由直徑2~3mm的玻璃棒彎曲成L形制成。2．培養(yǎng)基：固體、半固體、液體培養(yǎng)基。某些特殊成分（如染料、膽鹽、指示劑等）應(yīng)在矯正PH后加入。3）水浴低溫滅菌法：將血清、腹水、組織液等配制的培養(yǎng)基在水浴中加熱56~57℃維持1h，以保持液體狀態(tài)，連續(xù)5~7天，此法較少用。1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：一般分裝于錐形瓶，滅菌后備用，便于隨時(shí)分裝傾注平板或制備營養(yǎng)培養(yǎng)基。 試管號(hào) 培養(yǎng)基 蒸餾水 1（測(cè)試管） 5ml — 2（蒸餾水管） — 5ml —3（培養(yǎng)基管） 5ml — —第4管為標(biāo)準(zhǔn)PH比色管（配方見附錄二）。培養(yǎng)基的成分因種類不同而異，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有一般細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的基本營養(yǎng)成分，如：蛋白胨、肉浸液（或牛肉膏）、氯化鈉和水，這些營養(yǎng)物質(zhì)能為細(xì)菌提供生命所需的碳源、氮源、無機(jī)鹽、水分，并能調(diào)節(jié)菌體內(nèi)外的滲透壓，為細(xì)菌提供能量。3）吸管：于吸口端先墊入少許棉花(不可太松或太緊)，然后每支分別用紙包好，或以數(shù)支放入金屬筒內(nèi)。3）吸管：吸過病原微生物的吸管，應(yīng)插入盛有消毒液（3~5％來蘇）的玻璃筒中（筒底應(yīng)墊紗布或棉花，以免碰破吸管尖），使消毒液蓋過吸管，浸泡24h后，用5％肥皂水洗滌，再用自來水沖洗（若無病原微生物污染，則可用自來水浸泡或直接用自來水沖洗），晾干水后，用清潔液浸泡數(shù)小時(shí)，最后用自來水沖洗7次以上，晾干備用。3．掌握基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備程序、方法和注意事項(xiàng)。先用低倍鏡找到觀察部位，再換高倍鏡觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。4）加堿性美藍(lán)染色1min，水洗，待干，鏡檢。結(jié)果：菌體呈藍(lán)色，芽胞染成紅色。（5）玻片自然干燥后鏡檢。結(jié)果：有細(xì)胞壁的細(xì)菌僅菌體周邊染成紫色，菌體內(nèi)部無色；無細(xì)胞壁的細(xì)菌（如L型細(xì)菌）整個(gè)菌體都染成紫色。（3）水洗時(shí)，水流不能過大，防止水流直接對(duì)準(zhǔn)菌膜沖洗。用接種環(huán)先挑取生理鹽水1~2環(huán)于載玻片每格中央，再分別挑取大腸桿菌和葡萄球菌少許菌落與生理鹽水研勻。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、細(xì)菌染色的一般程序細(xì)菌染色法分單染法和復(fù)染法。（2）使用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本時(shí)間不宜太長(zhǎng)．因標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，即有熒光減弱現(xiàn)象。（2）先用低倍物鏡觀察，調(diào)節(jié)光環(huán)置中央后，在暗視野聚光器表面滴上香柏油（或水），再將標(biāo)本夾在移動(dòng)尺上。若油鏡鏡頭上的油跡未擦干凈，應(yīng)先將1:1醇醚混合液或二甲苯滴在擦鏡紙上擦拭鏡頭，再用干凈擦鏡紙將鏡頭上殘留的醇醚混合液或二甲苯擦凈。標(biāo)本觀察完畢后，先將物鏡頭移開，再轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使載物臺(tái)下降，取下載玻片，立即用擦鏡紙將鏡頭上的香柏油擦凈。將低倍鏡