【正文】 的使用方法：（1）將熒光顯微鏡置暗室，開啟光源，待光源穩(wěn)定并達到一定亮度（約5~10min）后，對準光軸。4．熟悉細菌的特殊染色法。（2）化學學說：革蘭陽性菌含有大量的核糖核酸鎂鹽，與進入胞漿內(nèi)的結晶紫和碘牢固結合成大分子復合物，不易被95%酒精脫色；而革蘭陰性菌含此種物質(zhì)少，故易被乙醇脫色。（4）染色：分以下四步：1min，水洗 1min，水洗 ，水洗 ，水洗結晶紫 盧戈碘液 95％乙醇 稀釋石炭酸復紅 待干、鏡檢（初染） （媒染） （脫色） （復染）3．結果：革蘭陽性菌染成紫色；革蘭陰性菌染成紅色。三、特殊染色法細菌的細胞壁、核質(zhì)、胞漿顆粒和細菌的特殊結構如芽胞、莢膜、鞭毛等，必須用相應的特殊染色法才能染上顏色。若水滴向周圍流散而不形成水珠表示玻片處理良好。（2）染色：分為以下三步。結果：菌體及背景均染成紫色，莢膜染成淡紫色或無色。四、不染色標本檢查法細菌未經(jīng)過染色呈無色透明，在顯微鏡下為有折光性的小點，不能判斷細菌的形態(tài)和結構特征。觀察要點：有鞭毛的細菌運動活潑，可向不同方向迅速運動，位置移動明顯。因此，微生物實驗所用的各種玻璃器材必須清洗干凈后才能使用。若用上述方法不能洗凈，可再置清潔液中浸泡數(shù)小時（針頭不能用清潔液泡），取出用自來水沖洗7次以上，干燥后備用。注意：任何已滅菌的器材。（2）溶化：將調(diào)配好的混合物置電爐上隔水加熱，使其完全溶解，注意隨時攪拌，防止溶液外溢，溶解完畢，應補足失去的水分。在培養(yǎng)基中加入NaOH后需再測一次PH，如仍未達到所需PH，再按上述方法進行矯正。4）瓊脂高層培養(yǎng)基：分裝于試管，量為試管高度的2/3，滅菌后趁熱將試管直立凝固。2）效果檢驗：將已知菌種接種于培養(yǎng)基上，觀察細菌的生長情況、生化反應等是否符合?！窘Y果記錄和報告】實驗四 細菌的接種培養(yǎng)法與生長現(xiàn)象的觀察【目的和要求】1．掌握無菌技術，建立無菌觀念；明確無菌操作時注意要點。目前實驗室常用的是經(jīng)濟實用的300~500W電熱鎳鉻絲。方法：（圖42）（1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許細菌。（4）在試管上做好標記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結果。圖44 固體培養(yǎng)基連續(xù)劃線法（2）分區(qū)劃線法（圖45）1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。（3）試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。（1）方法：1）將標本用無菌生理鹽水稀釋成不同濃度：10101010105等。角，劃線要密而不重復，充分利用培養(yǎng)基，并注意不能劃破平板。2．CO2培養(yǎng)法（1）CO2孵育箱：能自動調(diào)節(jié)箱內(nèi)CO2的濃度和溫度，使用方便。4．厭氧培養(yǎng)法：（1）厭氧罐培養(yǎng)法：用理化方法使容器內(nèi)形成無氧環(huán)境，用于專性厭氧菌培養(yǎng)。袋中裝有催化劑鈀粒和2支安瓿，分別裝有HCO2發(fā)生器（化學藥品，成分同上）、指示劑美藍。箱側有一交換室，具有內(nèi)外二門，內(nèi)門通箱內(nèi)先關著。（2）有鞭毛的細菌：沿穿刺線向四周擴散生長，穿刺線邊緣呈羽毛狀，周圍培養(yǎng)基變渾濁（如大腸埃希菌）。2．掌握常用生化反應的原理和方法。細菌的生化反應很多，本次實驗著重介紹一些最常用、最基本的試驗，其余部分可參見附錄。2）將其中的葡萄糖換成其他的糖（或醇），就可以做成其他糖（或醇）的發(fā)酵管。 臨床應用：該試驗主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別，前者為陽性，后者為陰性。（2）方法：1）將細菌種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)24~48h。臨床應用：常用于腸桿菌科屬間的鑒別，沙門菌屬（甲型副傷寒沙門菌除外）、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等多為陽性，其他菌屬為陰性?！　　　　　　　　　　　　　∮|酶H２Ｏ２　→　H２O＋［Ｏ］２［Ｏ］→ Ｏ２　↑ （2）方法：方法1：取3%，或加入到不含血液的肉湯培養(yǎng)物中，立即觀察結果。方法2：濾紙法，取潔凈濾紙一小塊，沾取菌落或菌苔少許，然后滴加試劑于其上。、工作原理、使用方法、注意事項和應用。2．水中細菌檢查 （1）方法：1）用無菌三角燒瓶以無菌的方法采集水樣（自來水、河水均可）。2）接種 以無菌方法用棉簽在瓊脂平板的一角(1/4處)來回劃線，去掉棉拭，然后用接種環(huán)在原劃線上過2~3下，接著往下劃線分離。（2）取上述接種大腸桿菌和枯草桿菌的肉湯各一管，放于100℃水浴中，加熱煮沸，維持5min，取出置冷水中冷卻，做好標記。（3）注意事項：1）滅菌時溫度不能超過180℃，否則布料、紙張等易起火燃燒。（2）使用方法（以電熱直立式高壓滅菌器為例）：1）準備：向鍋內(nèi)加水至水位線為止。（3）注意事項：1）每次滅菌前應檢查滅菌器是否處于良好的工作狀態(tài), 尤其是安全閥是否良好。7）定期檢查滅菌效果。若變?yōu)辄S色混濁，說芽胞未被殺滅，滅菌失敗。（3）結果：A和B平板除了紙片和玻璃遮住的部分有細菌生長以外，其它地方都無菌生長；C平板不長菌?！驹噭┡c器材】1．培養(yǎng)基：一般需氧和兼性厭氧菌采用水解酪蛋白（MH）瓊脂或MH液體培養(yǎng)基（~）。有效期為6個月。（3）細菌接種：用無菌棉拭蘸取已調(diào)試的菌液，在管壁上稍加擠壓之后，手持棉拭于MH瓊脂表面均勻劃線接種，共劃3次，每次將平板旋轉60176。購買培養(yǎng)基時應考慮其質(zhì)量，對每批MH瓊脂平板均需用標準菌株檢測，合格后方可使用。（4）培養(yǎng)溫度以35℃為宜。二、 試管稀釋法 1．原理將待測細菌種于一系列含有不同濃度抗菌藥物的液體培養(yǎng)基中，定量測定抗菌藥物抑制或殺死該菌的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）或最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration,MBC）。3．結果判斷及報告將試管拿出逐一對光觀察，凡無肉眼可見細菌生長的藥物最低濃度即為對待測菌的最低抑菌濃度（MIC）。（4）結果應在12~18h內(nèi)觀察，培養(yǎng)時間過長，被輕度抑制的部分細菌可能會重新生長，由于某些抗菌藥物不夠穩(wěn)定，時間長了其抗菌活性也會降低，甚至消失，從而使MIC增高。當其他PBPs被β－內(nèi)酰胺類抗生素抑制而不能發(fā)揮作用時，PBP2α可替代它們完成細菌細胞壁的合成，從而使細菌得以生存。（4）注意事項：1）頭孢西丁法結果觀察時應使用反射光線。（1）篩選試驗（紙片擴散法）1）藥物紙片：頭孢泊肟(Cefprozil,CPD)10μg/片 或頭孢他啶(Ceftazidime,CAZ) 30μg/片 或氨曲南(Aztreonam,ATM) 30μg/片 或頭孢噻肟(Cefotaxime,CTX) 30μg/片 或頭孢曲松(Ceftriaxone,CRO) 30μg/片） 2）方法：，稍干后，在瓊脂培養(yǎng)基表面貼上頭孢他啶等藥物紙片（同KB法），之后放35℃溫箱中培養(yǎng)1618h觀察結果。自1983年德國首次發(fā)現(xiàn)報道以來，在全世界ESBLs檢出率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢。由于頭孢西丁和苯唑西林較甲氧西林穩(wěn)定，不易失活，通常使用這兩種藥物代替甲氧西林測定葡萄球菌的耐藥性。目前臨床的自動化或半自動化的藥敏試驗多采用與次類似的微量稀釋法。（2）抗菌藥物必須使用標準粉劑，不應使用口服藥而影響其含量。（3）試驗方法：1）排列試管：取無菌試管10~15支排列于試管架上，除第一管外，其余每管加入MH液體培養(yǎng)基1ml。5．質(zhì)量控制：以新鮮傳代的金黃色葡萄球菌ATCC2592大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853等標準菌株在相同條件下用與常規(guī)試驗相同的方法測定對同種抗菌藥物的敏感性，標準菌株的抑菌環(huán)應在預期的范圍內(nèi)。長期儲存須置20℃的冰箱，日常使用或沒用完的紙片應及時放4℃保存，用時須提前1~2 h取出放室溫平衡。紙片一旦接觸瓊脂表面，就不能再移動。KB法是由Kirby Bauer 建立，美國NCCLS推薦，目前為世界所公認的標準紙片擴散法（定性法）。不同種類的待測菌藥敏試驗選擇不同的抗菌藥物，藥敏紙片的選擇見表71。（5）適用范圍：因紫外線的穿透力差，故只使用于空氣和物體表面的消毒。（2）試驗方法：1）取A、B、C 3個普通平板，分別將葡萄球菌劃線接種于平板上。③生物學指示法：是高壓蒸汽滅菌中檢測效果中最可靠的一種方法。4）加熱過程中，注意其壓力表指針勿超過警戒線。打開放氣閥，排凈鍋內(nèi)冷空氣，直到壓力表降回到“0”時，關閉氣閥，再繼續(xù)加熱。兩桶底部之間的空隙用來盛水，通過里面的電熱管使水加熱（或直接用明火對鍋底加熱）。由底部的電爐絲（或電熱器）加熱，并通過箱內(nèi)的感溫管和溫度控制器自動控制和保持所需溫度。（2）伸出任一手指在“消毒前”的培養(yǎng)基表面輕輕按一下，%碘酊、75%酒精做皮膚消毒（注意皮膚消毒方法）待干后，再在“消毒后”的培養(yǎng)基上輕輕一按。（2）結果觀察報告：取出平板，對光觀察其上有無菌落形成，并計數(shù)平板上的菌落，紀錄結果，以每毫升水中的菌落數(shù)（或CFU/ml）報告之。3．菌種：大腸桿菌、枯草桿菌、葡萄球菌。臨床應用：主要用于腸桿菌科細菌與假單胞菌的鑒別，前者為陰性，后者為陽性。也可用于其他細菌的鑒別。3．結果觀察：在24~48h內(nèi)如果培養(yǎng)基變深藍色有細菌生長為陽性。臨床應用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒別。2）取出，%，放48~50℃水浴2h（或37℃4h），充分搖動后，觀察結果。2．甲基紅試驗（MR試驗）（1）原理：某些細菌如大腸桿菌能將葡萄糖分解成丙酮酸，并進一步將丙酮酸分解成大量有機酸（甲酸、乙酸、乳酸等），加入甲基紅指示劑后顯紅色為試驗陽性。（2）方法： 1）葡萄糖發(fā)酵管的制備：取經(jīng)高壓滅菌并經(jīng)加熱融化的半固體瓊脂100ml，以無菌操作加入經(jīng)煮沸消毒的20%葡萄糖水溶液5ml、1%，混勻之后，趁熱倒入小試管并冷卻凝固。3．試劑：甲基紅試劑、40%KOH、靛基質(zhì)試劑、3%H2O1％鹽酸四甲基對苯二胺（或1％鹽酸二甲基對苯二胺）。不同細菌菌落的形態(tài)學特征不同，可以鑒別細菌。該法適于作厭氧菌的大量培養(yǎng)研究。（5）庖肉培養(yǎng)基法：將庖肉培養(yǎng)基上面的石蠟熔化，用毛細管吸取標本后接種于培養(yǎng)基中，待石蠟凝固后置37℃孵育。每次觀察標本后需重新抽氣換氣，用過的鈀粒經(jīng)160℃2h干烤后可重復使用。（見圖47）圖47 燭缸法（3）化學法（重碳酸鈉鹽酸法）：，分別將二種試劑置于容器內(nèi)，將容器放置在標本缸中，密封后傾斜容器，使二種試劑接觸混合產(chǎn)生CO2。發(fā)生有菌材料污染應及時進行消毒處理。（2）所有操作均需在酒精燈火焰附近進行，平皿蓋、試管塞、瓶塞均應拿在手上打開（具體見前述），禁止將蓋或塞事先取下放置在桌面上。（2）直接涂布法：多用于紙片法和管碟法藥敏試驗。4）在平板底上做好標記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結果。角，將已挑取細菌的接種環(huán)先在平板一側邊緣均勻涂布，然后運用腕力將接種環(huán)在平板上自上而下，來回劃線。（5）在試管上做好標記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結果。2．L形玻棒：由直徑2~3mm的玻璃棒彎曲成L形制成。2．培養(yǎng)基：固體、半固體、液體培養(yǎng)基。某些特殊成分（如染料、膽鹽、指示劑等）應在矯正PH后加入。3）水浴低溫滅菌法：將血清、腹水、組織液等配制的培養(yǎng)基在水浴中加熱56~57℃維持1h，以保持液體狀態(tài)，連續(xù)5~7天，此法較少用。1）基礎培養(yǎng)基：一般分裝于錐形瓶，滅菌后備用，便于隨時分裝傾注平板或制備營養(yǎng)培養(yǎng)基。 試管號 培養(yǎng)基 蒸餾水 1（測試管） 5ml — 2（蒸餾水管） — 5ml —3（培養(yǎng)基管） 5ml — —第4管為標準PH比色管（配方見附錄二）。培養(yǎng)基的成分因種類不同而異，其中基礎培養(yǎng)基含有一般細菌生長所需要的基本營養(yǎng)成分，如：蛋白胨、肉浸液（或牛肉膏）、氯化鈉和水，這些營養(yǎng)物質(zhì)能為細菌提供生命所需的碳源、氮源、無機鹽、水分，并能調(diào)節(jié)菌體內(nèi)外的滲透壓，為細菌提供能量。3）吸管：于吸口端先墊入少許棉花(不可太松或太緊)，然后每支分別用紙包好，或以數(shù)支放入金屬筒內(nèi)。3）吸管：吸過病原微生物的吸管，應插入盛有消毒液（3~5％來蘇）的玻璃筒中（筒底應墊紗布或棉花，以免碰破吸管尖），使消毒液蓋過吸管，浸泡24h后，用5％肥皂水洗滌，再用自來水沖洗（若無病原微生物污染，則可用自來水浸泡或直接用自來水沖洗），晾干水后，用清潔液浸泡數(shù)小時，最后用自來水沖洗7次以上，晾干備用。3．掌握基礎培養(yǎng)基的制備程序、方法和注意事項。先用低倍鏡找到觀察部位，再換高倍鏡觀察細菌的運動。4）加堿性美藍染色1min，水洗，待干，鏡檢。結果：菌體呈藍色，芽胞染成紅色。（5）玻片自然干燥后鏡檢。結果：有細胞壁的細菌僅菌體周邊染成紫色，菌體內(nèi)部無色；無細胞壁的細菌（如L型細菌）整個菌體都染成紫色。（3）水洗時，水流不能過大，防止水流直接對準菌膜沖洗。用接種環(huán)先挑取生理鹽水1~2環(huán)于載玻片每格中央，再分別挑取大腸桿菌和葡萄球菌少許菌落與生理鹽水研勻?！緦嶒瀮?nèi)容】一、細菌染色的一般程序細菌染色法分單染法和復染法。（2）使用熒光顯微鏡觀察標本時間不宜太長．因標本在高壓汞燈下照射超過3min，即有熒光減弱現(xiàn)象。（2）先用低倍物鏡觀察，調(diào)節(jié)光環(huán)置中央后，在暗視野聚光器表面滴上香柏油（或水），再將標本夾在移動尺上。若油鏡鏡頭上的油跡未擦干凈，應先將1:1醇醚混合液或二甲苯滴在擦鏡紙上擦拭鏡頭，再用干凈擦鏡紙將鏡頭上殘留的醇醚混合液或二甲苯擦凈。標本觀察完畢后，先將物鏡頭移開，再轉動粗調(diào)節(jié)器使載物臺下降，取下載玻片，立即用擦鏡紙將鏡頭上的香柏油擦凈。將低倍鏡