realtimepcr詳解--文庫(kù)吧在線(xiàn)文庫(kù)
【正文】 系中形成的引物二聚體的影響 ?可以用水解探針代替 SYBR Green I， 有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)使用水解探針的敏感性要比 SYBR Green I高出 10倍 。 如何設(shè)計(jì)熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)方案 ? 根據(jù)儀器和個(gè)人的喜好，確定熒光定量 PCR的方法，選擇熒光素的種類(lèi) ? 合成引物和探針 ? 收集樣品、提取 RNA或 DNA（ 80℃ 保存，避免反復(fù)凍融 ） ? 制備標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)粒、化學(xué)合成的目的基因） ? 拷貝數(shù) =質(zhì)量 247。特別是 G，不可超過(guò) 4個(gè)及以上 ? 用 Primer Express軟件計(jì)算出來(lái)的 Tm值應(yīng)當(dāng)在 5860 ℃ 之間 ? 3’的 5個(gè)堿基中 G 和 /或 C堿基的總數(shù)不能超過(guò) 2個(gè) ? 引物和探針的設(shè)計(jì)原則的重要程度由上往下越來(lái)越低 ? 如果是設(shè)計(jì) SYBR Green I引物，也要選擇 TaqMan Primer and Probe design并遵守這些規(guī)則，但是只需要合成引物就可以了。 ?可以使用熱啟動(dòng)辦法或使用特殊處理的 Taq酶 ?要盡可能地優(yōu)化引物設(shè)計(jì) ?如果反應(yīng)體系中出現(xiàn) PCR的抑制因素
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