【正文】 的不對(duì)稱性微孔膜、按照截留分子量的大小，可分離30一些含羥基、羧基、氨基和巰基的藥物，可與內(nèi)源性物質(zhì)葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷綴合物；還有一些含酚羥基、芳胺及醇類藥物與內(nèi)源性物質(zhì)硫酸形成硫酸酯綴合物。這些條件應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。~，37℃培育數(shù)小時(shí)進(jìn)行水解。例如尿中的甾體硫酸酯在pH分析方法的效能指標(biāo)包括特異性、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍、定量下限、精密度與準(zhǔn)確度。（一）特異性方法的特異性，又稱選擇性，用以證明該方法所測(cè)定的物質(zhì)是預(yù)期的待測(cè)物（原形藥物或特定的活性代謝物），而體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)、降解產(chǎn)物及其他共同使用的藥物（伍用藥物）不干擾樣品的測(cè)定。必要時(shí)可通過(guò)HPLCDAD和LCMS（或LCMS/MS）確證被測(cè)定色譜峰的純度。最常用的回歸分析法為最小二乘法（least內(nèi)標(biāo)溶液的濃度一般選擇與系列“標(biāo)準(zhǔn)溶液”的幾何平均濃度，即標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間濃度（如系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為50和100時(shí)，中間濃度為10）相當(dāng)。of在藥代動(dòng)力學(xué)與生物利用度研究中，LLOQ應(yīng)能滿足3~5個(gè)消除半衰期時(shí)體內(nèi)樣品中的藥物濃度或Cmax的1/20～1/10的藥物濃度的測(cè)定。RR）或相對(duì)偏差（relative為獲得批間RSD，應(yīng)在不同天（一般為3天）連續(xù)制備并測(cè)定QC樣品，至少有連續(xù)3個(gè)分析批，不少于45個(gè)樣品的分析結(jié)果。 （六）提取回收率提取回收率（extraction 在藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度研究中，高、中、低QC樣品的提取回收率應(yīng)一致、精密和可重現(xiàn)。2．限度要求 另取空白生物介質(zhì)，照QC樣品同法處理后，加入等量的標(biāo)準(zhǔn)溶液（必要時(shí)除去溶劑），同法制備相同的高、中、低3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品，同法測(cè)定。測(cè)定法方法是取高、低兩個(gè)濃度的QC樣品，于適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)，在上述規(guī)定條件下存放不同時(shí)間后測(cè)定，每個(gè)QC樣品重復(fù)測(cè)定3次，其平均值的偏差應(yīng)在零時(shí)測(cè)定值的177。精密度一般要求RSD不超過(guò)15%，在LLOQ附近RSD應(yīng)不超過(guò)20%。每個(gè)QC樣品測(cè)定1次。準(zhǔn)確度（accuracy）是指在確定的分析條件下測(cè)得的體內(nèi)樣品濃度與真實(shí)濃度的接近程度，通常用QC樣品的實(shí)測(cè)濃度與標(biāo)示濃度的相對(duì)回收率（relative（三）定量下限定量下限（LLOQ）是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，表示方法的靈敏度，即測(cè)定樣品中符合準(zhǔn)確度和精密度要求的最低藥物濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍要能覆蓋全部待測(cè)的體內(nèi)樣品濃度范圍，定量上限（upper濃度系列一般為等比梯度模式，通常比例常數(shù)約為2，如50、100。curve）或工作曲線（workingsample）第四部分 體內(nèi)分析方法的建立與方法驗(yàn)證一、體內(nèi)分析方法建立的一般程序取待測(cè)藥物或其特定的活性代謝產(chǎn)物、內(nèi)標(biāo)等的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行條件試驗(yàn)，通過(guò)調(diào)整色譜條件，使待測(cè)藥物與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)具有良好的色譜參數(shù)及峰面積，并有效避開(kāi)內(nèi)源性物質(zhì)的干擾；同時(shí)選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器，以獲得足夠的檢測(cè)靈敏度。前者可專一地水解藥物的葡萄糖醛酸苷綴合物，后者水解藥物的硫酸酯綴合物。酸水解時(shí)，可加入適量的鹽酸溶液。綴合物水解藥物或其代謝物與體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合生成的產(chǎn)物稱為綴合物（conjugate）。全自動(dòng)化儀器是通過(guò)柱切換技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，利用切換閥使固相萃取小柱直接聯(lián)入流路中。④淋洗用甲醇潤(rùn)濕小柱，活化填料，以使固相表面易于和待測(cè)組分發(fā)生分子間相互作用，同時(shí)可以除去填料中可能存在的干擾物質(zhì)。常見(jiàn)的商品SPE柱有SepPakextraction，SPE）技術(shù)。這樣，就可使得90%的藥物以非電離形式存在，而更易溶于有機(jī)溶劑中。溶劑的選擇（二）液液萃取法（liquidliquid含藥物血清與強(qiáng)酸的比例為1∶，高速離心約2分鐘，就可以除去90%以上的蛋白質(zhì)。加入中性鹽，溶液的離子強(qiáng)度發(fā)生變化，部分蛋白質(zhì)的電性被中和，蛋白質(zhì)因分子間電排斥作用減弱而凝聚。含藥物的血漿或血清與水溶性有機(jī)溶劑的體積比為1:（2~3）時(shí)，可以將90%以上的蛋白質(zhì)除去。特殊情況下需進(jìn)行綴合物水解、化學(xué)衍生化等。滿足測(cè)定方法的要求勻漿化操作系將組織樣品中加入一定量的水或緩沖液，在刀片式勻漿機(jī)中勻漿，使待測(cè)藥物釋放、溶解，分取上清液測(cè)定。唾液樣品采集后，應(yīng)立即測(cè)量其除去泡沫部分的體積。但由于易受食物種類、飲水多少、排汗情況等影響，常使尿藥濃度變化較大，故測(cè)定尿液中藥物濃度時(shí)，一般采用時(shí)間尿（一定時(shí)間區(qū)間的尿液），以某一時(shí)間段或單位時(shí)間內(nèi)尿中藥物的總量（排泄量或排泄率）表示。尿樣包括隨時(shí)尿、晨尿、白天尿、夜間尿及時(shí)間尿幾種。但無(wú)論是采用血漿還是血清，現(xiàn)有的文獻(xiàn)、資料所列的血藥濃度，均系指血漿或血清中藥物的總濃度（游離+與血漿蛋白結(jié)合）。3.根據(jù)分析方法靈敏度的要求，一般每次采血量1~5ml；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，可直接從動(dòng)脈或心臟取血。而臟器組織，除非特別需要，在治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM）中很少使用。生物學(xué)方法體內(nèi)樣品大都具有以下性質(zhì)特點(diǎn)：①采樣量少，采樣量一般為數(shù)毫升至數(shù)十微升，且在特定條件下采集，不易重新獲得。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)體化治療成為新的理念。這些研究中，建立有效的體內(nèi)藥物分析方法是首要任務(wù)。在測(cè)定體內(nèi)藥物及其特定代謝物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)時(shí)，除少數(shù)情況將體液作簡(jiǎn)單處理后可直接測(cè)定外，通常在測(cè)定之前要對(duì)體內(nèi)樣品進(jìn)行分離凈化與濃集等樣品前處理，從而為體內(nèi)樣品中藥物的測(cè)定提供良好的環(huán)境與條件。色譜分析法3.唾液因采集便利且有時(shí)與血漿游離藥物濃度具有相關(guān)性而時(shí)有使用。人體采血，通常采集靜脈血，有時(shí)從毛細(xì)血管采血（成人多從手指或耳垂取血，小兒多從腳趾取血）用于臨床化驗(yàn)。肝素是體內(nèi)正常生理成分，因此不致改變血樣的化學(xué)組成或引起藥物的變化