最權(quán)威最齊全的pcr匯總及其原理-程序(存儲版)
【正文】 監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。 應(yīng)用行業(yè)：各級各類醫(yī)療機構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品多重PCR單純皰疹病毒的分型。此外，遞減PCR還可與簡并引物(degenerate primer)結(jié)合使用，用來推出一段已知肽鏈的氨基酸序列所對應(yīng)的DNA堿基序列。這樣在起初的幾個循環(huán)中，特異性擴增序列可以相對非特異性序列多擴增若干倍，從而減輕非特異性擴增對結(jié)果的干擾。有時是乙丙型肝炎病毒重疊.②腸道致病性細菌的檢測，如傷寒，痢疾和霍亂，有時具有較相同的腸道癥狀，有時痢疾霍亂同存一病人并同時發(fā)病.③性病的檢測，如梅毒，淋病及艾滋病的診斷.④戰(zhàn)傷細菌及生物戰(zhàn)劑細菌的檢測，如破傷風桿菌，產(chǎn)氣莢膜桿菌，炭疽桿菌，鼠疫桿菌等偵檢.⑤需特殊培養(yǎng)的無芽胞厭氧菌，如脆弱類桿菌、艱難桿菌的鑒定等. 某些病原微生物，某些遺傳病或癌基因，型別較多，或突變或缺失存在多個好發(fā)部位，多重PCR可提高其檢出率并同時鑒定其型別及突變等可系統(tǒng)應(yīng)用的有:乙型肝炎病毒的分型。 食品安全：食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測。但還是建議先排除一下其他可能因素，畢竟普通PCR簡單。cDNA第二對引物的功能是特異性的擴增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片斷。巢式PCR 原理 DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛3磷酸脫氫酶）、βActin（β肌動蛋白）等。在適當?shù)臏囟葏?shù)下擴增2832個循環(huán)。42℃孵育25min。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴增。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。 RT PCR（Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction）即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。 反轉(zhuǎn)錄PCR mM ( mM)的硫酸鎂作初步實驗。 一步法 RTPCR引物的選擇： 1. 隨機引物 適用于長的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA。cDNA的合成首先在反轉(zhuǎn)錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進行PCR。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組 DNA的污染。最適作用溫度為37176。 兩步法 2. Oligo dT 適用于具有PolyA尾巴的RNA。 大多數(shù)目標RNA經(jīng)40輪PCR反應(yīng)就能觀察到?！ ?RTPCR反應(yīng)原理反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction，RTPCR）又稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR。最適作用溫度為37℃。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA?，F(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。 （5）將管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解殘留的RNA。 ?。?） 密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進行密度掃描。故對于每一個目標序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨實驗來確定。巢式PCR 定義 巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可
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