血紅蛋白的提取與分離(1)(存儲(chǔ)版)
【正文】 白質(zhì)發(fā)生完全變性。血紅蛋白由四個(gè)肽鏈組成 (如圖 )，包括兩個(gè) α 肽鏈和兩個(gè) β 肽鏈。 實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理 紅細(xì)胞的洗滌 洗滌紅細(xì)胞的目的是 去除雜蛋白 ，以利于后續(xù)步驟的分離純化。 問(wèn)： 采用什么方法分離血紅蛋白？ 離心分層后， 各層的成分 各是什么？ 用濾紙過(guò)濾，去掉什么成分？ 實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理 取 1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有 300mL的物質(zhì)的量濃度為 20mmol/L的 磷酸緩沖液中（ pH為 ），透析 12h。柱底部的制作方法如下 (圖 519)。因?yàn)楦傻哪z和用緩沖液平衡好的凝膠的體積差別很大，因此裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的凝膠量。（ 因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每 5 mL收集一管，連續(xù)收集(圖 5— 21)。 實(shí)驗(yàn)操作 （二）凝膠色譜操作 問(wèn)： 正確的加樣操作，注意什么？ 不要觸及破壞凝膠面 貼壁加樣 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng) 答：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的 pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無(wú)效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò)，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。 你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過(guò)程中，紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎？請(qǐng)描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)情況，并據(jù)此判斷分離效果？ 結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 練習(xí) 1．答：凝膠色譜法也稱(chēng)為分配色譜法，它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。在生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過(guò)程都是在精確的 pH下進(jìn)行的，受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控。 練習(xí) 。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物（緩沖劑）溶解于水中制得，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同 pH范圍的緩沖液。 如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過(guò)的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢。（ 在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功 ）。等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。 實(shí)驗(yàn)操作 （二）凝膠色譜操作 問(wèn) :凝膠的選擇材料 ? G代表意義 ? 簡(jiǎn)單步驟 ? 注意點(diǎn)： 實(shí)驗(yàn)操作 （二）凝膠色譜操作 選擇交聯(lián)葡聚糖凝膠（ G75） “ G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍 , 75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水 。 打孔 挖穴 安管 覆網(wǎng) 紗包 插管 注意事項(xiàng)： 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。 實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理 實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理 閱讀課本相關(guān)內(nèi)容，了解凝膠色譜的操作過(guò)程。從上往下數(shù)，第 1層為無(wú)色透明的甲苯層，第 2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第 3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第 4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。 實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理 速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果。市場(chǎng)上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售 實(shí)驗(yàn)操作 閱讀 課本相關(guān)內(nèi)容， 思考 以下問(wèn)題： 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分成幾步？ 樣品怎樣處理？ 蛋白質(zhì)怎樣分離？ 實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理 樣品處理 —— 粗分離 —— 純化 —— 純度鑒定 問(wèn)： 蛋白質(zhì)提取和分離步驟？ 血液 血 漿 水分 固體物質(zhì) 血漿蛋白 無(wú)機(jī)鹽 磷脂 葡萄糖等 血細(xì)胞 白細(xì)胞 血小板 紅細(xì)胞 （最多） 血紅蛋白 （ 90％） 2個(gè) a－肽鏈 2個(gè) β 一肽鏈 4個(gè)亞鐵紅素基團(tuán) ① 血液組成 實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理 血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中紅細(xì)胞最多。 ⑤ SDS作用機(jī)理 ④ SDS作用 為了消除 靜電荷對(duì)遷移率的影響 可以在凝膠中加入 SDS。電泳利用了待分離樣品中各種分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的（ ），從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 問(wèn)： 在生物化學(xué)的研究工作，為什么要正確配制緩沖溶液和準(zhǔn)確測(cè)定緩沖溶液的 pH？ 閱讀 第 65頁(yè)的相關(guān)內(nèi)容， 回答 以下問(wèn)題： 電泳的概念； 電泳的原理； 電泳的種類(lèi)； SDS的作用。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。a (n m)主要是對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究 課題 3 血紅蛋白的提取和分離 課題背景 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)。 蛋白質(zhì)組： 生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的總和。所以對(duì)于一條多肽鏈說(shuō)，至少應(yīng)有的
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