【正文】 2022/6/4 70 ?凝膠粒度的選擇： 一般來說，細(xì)顆粒分離效果好，但流速慢；而粗顆粒流速快，但會(huì)使區(qū)帶擴(kuò)散，使洗脫峰變平而寬。 對(duì)于玻璃層析柱 其方法是：將凝膠從柱柱中取出，將已使用過的凝膠先用 ，用水洗至中性，再裝柱。 3）通常新裝的凝膠柱用適當(dāng)?shù)木彌_溶液平衡后，將帶色的蘭葡聚糖 –2022溶液過柱，觀察色帶是否均勻下移，以鑒定新裝柱的技術(shù)質(zhì)量是否合格，否則，必須重新裝填。樣品體積過大，分離效果不好。 ? ：可用 20%乙醇或 %疊氮鈉保存。 2022/6/4 82 總 結(jié) ?對(duì)抗生素中高分子雜質(zhì)的分析根據(jù)不同品種的特點(diǎn)和不同質(zhì)控要求靈活掌握，優(yōu)先采用凝膠色譜法，但不排除其它驗(yàn)證良好的其它分析系統(tǒng)的應(yīng)用，對(duì)不同品種，視分離情況和分離要求，將 Sephadex G10 和高效凝膠色譜系統(tǒng)綜合應(yīng)用。（外源性雜質(zhì)、內(nèi)源性雜質(zhì)） ? 雜質(zhì)和 兩大類。（ 4℃ ） 2022/6/4 86 復(fù)習(xí)題 ? 1. ?內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定中影響分離度的因素（ ABCD） ? A．與洗脫劑的組成有關(guān) B．與流動(dòng)相的離子強(qiáng)度有關(guān) ? C．與流動(dòng)相的 PH有關(guān) D．與流動(dòng)相的流速有關(guān) ? ，離子強(qiáng)度越大， β內(nèi)酰胺類抗生素的 Kav值（ B）。 ? 3）流動(dòng)相 pH的影響 當(dāng)流動(dòng)相中有多元酸 /鹽存在時(shí)， pH通過影響多元酸的解離，改變緩沖液中的陰離子類型，來改變?nèi)苜|(zhì)的保留時(shí)間。 ? 3）防止柱受污染：可用 與 。 2022/6/4 91 復(fù)習(xí)題 ? ？ ? 1）葡聚糖凝膠耐受壓力為 ，過高壓力會(huì)損傷填料性能。 2022/6/4 89 復(fù)習(xí)題 ? 3. 簡(jiǎn)述影響 ?內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定中分離度的因素？ ? 1）流動(dòng)相離子強(qiáng)度對(duì)溶質(zhì)保留行為的影響： 離子強(qiáng)度越大， β內(nèi)酰胺類抗生素的 Kav值越大。（蒸餾水） ? ，應(yīng)在 儲(chǔ)藏。 ? ：是指高分子聚合物與藥物單體之間分離程度（或分離能力）。若儲(chǔ)藏溫度低于 0 ℃ ，則會(huì)降低柱效。 ? ，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。一般來說，加樣量越少或加樣體積越小 (樣品濃度高 )，分辨率越高。 2022/6/4 74 ?裝柱要點(diǎn)： 1）凝膠漿濃度應(yīng)適宜（一般為 70%水混懸液），分散均勻不結(jié)團(tuán)（不宜強(qiáng)烈攪拌）。 一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的 2倍，例如 Sephadex G20的吸水量為 20， 1 克 Sephadex G─20吸水后形成的凝膠體積約 40ml。內(nèi)部常含有大量液體。 ABAsfT2) (峰??的拖尾因子A B10 %峰 高5 %峰 高2022/6/4 63 RSD 考察對(duì)照品在流動(dòng)相 B系統(tǒng)中重復(fù)進(jìn)樣后峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)符合規(guī)定。 2022/6/4 51 高分子雜質(zhì) 樣品主峰 2022/6/4 52 ? 內(nèi)標(biāo)法是結(jié)合了峰面積歸一法和外標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)的一種方法，它在加入內(nèi)標(biāo)后，按峰面積歸一法的分析方法進(jìn)行分析，這就避免了由于進(jìn)樣的一致性及樣品歧視效應(yīng)導(dǎo)致的偶然誤差，因而，它的分析精密度也是比較高的，是氣相色譜的一種比較理想的定量分析方法。此時(shí)，在 Sephadex G10凝膠色譜系統(tǒng)中和高分子雜質(zhì)具有相似的色譜行為，即在kav=0處表現(xiàn)為單一的色譜峰。反之，溶質(zhì)的保留值增大。 2022/6/4 36 ? 在被測(cè)物濃度較高時(shí)，流動(dòng)相中應(yīng)含有足量的緩沖鹽以改善色譜峰形和分離效果。但是，在測(cè)定激酶等蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，不宜用藍(lán)色葡聚糖 2022測(cè)定外水體積，因?yàn)樗鼘?duì)激酶有吸附作用，所以有時(shí)用 巨球 蛋白 代替。 2022/6/4 24 ?實(shí)驗(yàn)證明， Sephadex G10 凝膠可基本保證所有的 β內(nèi)酰胺抗生素中的高分子雜質(zhì)被排阻。凝膠色譜法主要用于 高聚物 的相對(duì)分子質(zhì)量分級(jí)分析以及相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)試。有相關(guān)報(bào)道，在青霉素 V聚合物可經(jīng)胃腸道吸收而引發(fā)過敏反應(yīng)。 2022/6/4 12 ? ：青霉素、頭孢菌素不僅能形成聚合度不同的聚合物，許多樣品還能同時(shí)發(fā)生 不同機(jī)理 的聚合反應(yīng)。 2022/6/4 8 青霉噻唑蛋白的基本結(jié)構(gòu) 青霉素 G 內(nèi)酰胺環(huán)斷裂點(diǎn) 2022/6/4 9 ?青霉素聚合物： ，側(cè)鏈中的活性基團(tuán)不參與反應(yīng)。 半抗原 (hapten)：只有抗原性而沒有免疫原性的物質(zhì)，即只能與抗體結(jié)合，卻不能單獨(dú)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的物質(zhì)，稱為半抗原。 2022/6/4 4 ?內(nèi)源性雜質(zhì)：抗菌藥物自身聚合產(chǎn)物。 系對(duì)藥品中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)的總稱。 免疫原性 (immunogenicity)：抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，誘生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。 速發(fā)型過敏反應(yīng)是一種常見的過敏反應(yīng)，主要為呼吸道過敏反應(yīng)、消化道過敏反應(yīng)、皮膚過敏反應(yīng)以及過敏性休克。 2022/6/4 10 ?頭孢菌素：頭孢菌素中的高分子雜質(zhì)主要是不同類型的聚合物。 ? 生產(chǎn)工藝 密切相關(guān)，如氨芐西林鈉，溶媒法和噴霧干燥法的高分子雜質(zhì)具有不同的特異性，且二者的聚合物含量明顯不同。 β內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，可評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量和穩(wěn)定性，并可借此進(jìn)一步評(píng)價(jià)其生產(chǎn)工藝。 2022/6/4 21 凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn) ? （ 1）利用凝膠色譜的分子篩機(jī)制，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千埃。 Vt= Vo+ Vi+ Vg 柱床體積（ Vt） ：凝膠柱所能容納的總體積 2022/6/4 26 洗脫體積（ Ve） ：將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。 ?（ 4）即，色譜過程中除分子排阻作用外，凝膠對(duì) 藥物分子 的吸附作用 大于 對(duì) 高分子雜質(zhì)的吸附作用。 改變流動(dòng)相中緩沖液的種類，可以改變?nèi)苜|(zhì)的色譜行為，對(duì) β內(nèi)酰胺類抗生素，表現(xiàn)為其 Kav值的改變及色譜峰型的變化。也就是說，保留時(shí)間越大，半峰寬越大，峰型越難看。 含量 響應(yīng)值 (A或H) 定量方法： ? 外標(biāo)法 ? 內(nèi)標(biāo)法 ? 峰面積歸一法 ?主成分對(duì)照法 2022/6/4 49 ? 以 待測(cè)物質(zhì)的對(duì)照品 為參照物，根據(jù)供試品的量和對(duì)照品的量以及對(duì)應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行定量的方法。 2022/6/4 58 儀