【正文】 通過(guò)一級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)后，種量還不能滿足發(fā)酵用的需要，因此需要進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。 ? 溫度不要波動(dòng)太大；適當(dāng)通風(fēng)攪拌；注意種子培養(yǎng)時(shí)間。 ? (4)調(diào) pH ～ 。 ? 不含糊精、蛋白質(zhì)（起泡物質(zhì)）。 ? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型添加適量氨基酸主要以添加有機(jī)氮源水解液。 產(chǎn)酸階段： NH4+不足：使 ?酮戊二酸蓄積而很少有谷氨酸生成。 ? 鎂：是已糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶和羧化酶的激活劑，并促進(jìn)葡萄糖 6磷酸脫氫酶活力。 （ 1）作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰 CoA的輔酶，參與脂肪酸的生物合成，進(jìn)而影響 磷酯的合成。 第三節(jié) 谷氨酸發(fā)酵 ? 一、谷氨酸發(fā)酵控制原理 ? 發(fā)酵過(guò)程菌體變化 1）、適應(yīng)期： 尿素分解出氨使 pH上升。 發(fā)酵后期： 菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑汀? ? 0～ 12h的發(fā)酵前期，主要是長(zhǎng)菌階段； ? 發(fā)酵 12h后，菌體進(jìn)入平衡期，增殖速度變得緩慢； ? 溫度提高到 34～ 36℃ ，谷氨酸的生成量就增加。 ? 發(fā)酵過(guò)程中，由于菌體不斷利用氨，以及有機(jī)酸和谷氨酸等代謝產(chǎn)物進(jìn)入發(fā)酵液，使 N源不足和發(fā)酵液 pH下降，需再次流加尿素 。 ? 一級(jí)種子控制在 1112h，二級(jí)控制在 78h。 ? 供氧不足時(shí)產(chǎn)酸受輕微影響的天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵 溶解氧的控制 ? 在實(shí)際生產(chǎn)中，攪拌轉(zhuǎn)速固定不變，通常用調(diào)節(jié)通風(fēng)量來(lái)改變供氧水平。 ? 因此，控制 OD值的增長(zhǎng)，是保證菌體在胞外大量蓄積谷氨酸的重要手段。 ?處理： 如果發(fā)酵前期發(fā)現(xiàn)雜菌污染，可將培養(yǎng)基重新滅菌，并酌加培養(yǎng)基成分，重新接種后再發(fā)酵。 ② 種子質(zhì)量差引起的發(fā)酵異常 ? 將種齡過(guò)長(zhǎng)或活力弱的種子接入發(fā)酵罐后，在發(fā)酵中、后期，糖耗就變得緩慢， pH不下降、波動(dòng)不活躍，谷氨酸生成量少。 ? 如磷鹽過(guò)多，糖的降解都通過(guò) EMP和TCA，菌體增殖快。 ? 常速離心機(jī) 轉(zhuǎn)速 ≤8000r/min，相對(duì)離心力 ≤10kg ? 高速 x 104 r/min，相對(duì)離心力 10 100kg ? 超速 – 8 x 104 r/min，相對(duì)離心力 8 x 108kg 二 、沉淀分離 ? 沉淀分離是通過(guò)改變某些條件，使混合液中某種溶質(zhì)的溶解度降低，從溶液中沉淀析出，而與其他溶質(zhì)分離的技術(shù)。 三 、谷氨酸的離子交換層析 ? 原理： ? 它是利用離子交換劑上的可解離的基團(tuán)對(duì)各種離子的親和力的不同，而使不同物質(zhì)分離的技術(shù)。 pH過(guò)低，則中和不完全； pH過(guò)高，則生成較多谷氨酸二鈉，都會(huì)使谷氨酸鈉生成率降低。可以采用適當(dāng)?shù)碾x子交換樹(shù)脂進(jìn)行離子交換而除去。 四、 濃縮與結(jié)晶 ?經(jīng)過(guò)上述中和、除鐵、脫色處理以后，得到較純的谷氨酸鈉溶液。 發(fā)酵工藝進(jìn)展 ：亞適量生物素水平（產(chǎn)酸 4～ 6g／ dl） → 高生物素水平（產(chǎn)酸 12～ 15g／ dl）。在谷氨酸鈉結(jié)晶的干燥方面，常用的有真空干燥和氣流干燥等。 ? 脫色是在谷氨酸中和、除鐵以后進(jìn)行，中和液的 pH為 ～ 。 ? Fe2+ + Na2S → FeS + 2Na+ ? 由于硫化亞鐵在堿性條件下幾乎不溶于水，而在酸性條件下溶解度較大，所以在操作時(shí)為了除鐵較完全，應(yīng)控制好 pH，并加入稍過(guò)量的硫化鈉。 ? 中和作用所使用的堿是氫氧化鈉，使用的堿性鹽為碳酸氫鈉或碳酸鈉。 ? 加熱沉淀法 ? 經(jīng)加熱使混合液中微生物菌體和蛋白質(zhì)變性而沉淀。 ? 谷氨酸分離純化的方法主要有 離心分離、沉淀分離、過(guò)濾與膜分離、層析分離 等。磷在微生物細(xì)胞中含量較高，它是合成核酸、核蛋白、磷脂、各種核苷酸和輔酶的重要元素。 如果發(fā)酵中期發(fā)現(xiàn)感染噬菌體，將培養(yǎng)基在70℃ 加熱 10min殺死噬菌體，補(bǔ)料補(bǔ)種， 重新發(fā)酵。 ? 生物素過(guò)量，則發(fā)酵過(guò)程菌體大量繁殖，不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，你謝產(chǎn)物中乳酸和琥珀酸明顯增多。當(dāng)培養(yǎng)基的生物素將被耗盡時(shí)，細(xì)菌就停止增殖。 氧對(duì)氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 ? 要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸發(fā)酵：生物合成與 TCA循環(huán)有關(guān)。 種齡長(zhǎng)短關(guān)系到種子活力的強(qiáng)弱，影響下一次增殖的適應(yīng)期長(zhǎng)短。 pH的控制 ? 前期 ? 一般發(fā)酵前期 pH控制在 ，發(fā)酵中、后期 pH控制在 ～ ，調(diào)低 pH的目的在于提高與谷氨酸合成有關(guān)的酶的活力 。 溫度的控制。 措施： 及時(shí)流加尿素以提供足夠的氨并使 pH維持在 。 生物素含量高時(shí)，細(xì)胞膜致密，阻礙 Glu分泌，并引起反饋抑制，加適量青霉素可提高 Glu產(chǎn)量。 ? 銅離子：對(duì)氨基酸發(fā)酵有明顯毒害作用。 ? 磷酸鹽：對(duì)發(fā)酵有顯著影響。 氮源：銨鹽、尿素、氨水 C/N＝ 100： 15?21，實(shí)際高達(dá) 100： 28 因?yàn)椋?1）用于調(diào)整 pH。 四、發(fā)酵培養(yǎng)基的組成 （一）碳源 1. 碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烴 （ 1）淀粉水解糖的制備 （ 2）糖蜜原料 （ 3）碳源濃度過(guò)高時(shí)，對(duì)菌體生長(zhǎng)不利，氨基酸的轉(zhuǎn)化率降低。 ? 酸解液的中和 液堿 酸解液 pH ,調(diào)至 ? 酸解液的除雜 活性炭 干淀粉量 %, 6070℃,30min ? 水解糖液的質(zhì)量要求 : 還原糖 ≥ 18%； 糖液清 ,呈淺黃綠色 ,550nm處透光率≥ 90%；無(wú)糊精；糖液新鮮 ? 目前生產(chǎn)中多采用酶解法。一般采用加酸靜置，加酸調(diào) pH ～ ，并定時(shí)通風(fēng)，除溶液中的SO NO2等有害性揮發(fā)成分。 ? 二級(jí)種子培養(yǎng) ? 二級(jí)種子是在種子罐里培養(yǎng)的， ? 培養(yǎng)二級(jí)種子時(shí)的接種量為 %～ ％，溫度為 32～ 34℃ ，培養(yǎng)時(shí)間為 6～ 8h。 ? 一級(jí)種子培養(yǎng)基應(yīng)該營(yíng)養(yǎng)豐富，有利于菌體的生長(zhǎng)繁殖。 谷氨酸生產(chǎn)菌的生化特征 ? （ 4）谷氨酸脫氫酶活力高，有利于谷氨酸的生成。當(dāng)磷脂合成減少到正常量的一半左右時(shí)，細(xì)胞變形，谷氨酸向膜外漏出，積累于發(fā)酵液中 ? 控制生物素添加量使菌種生產(chǎn) Glu 高濃度 bio增強(qiáng)羧化酶活性，促進(jìn)羧化反應(yīng)利于 Glu合成。 ? 異檸檬酸脫氧過(guò)程中產(chǎn)生的 NADPH為還原氨基化反應(yīng)提供了必需的供氧體。 ? 過(guò)程中有 6磷酸果糖、 3磷酸甘油醛 和多量NADPH2生成，前兩者可以跟糖酵解途徑聯(lián)系起來(lái)，進(jìn)一步生成丙酮酸；后者是 a一酮戊二酸進(jìn)行還原氨基化反應(yīng)所必需的供氫體。 ? 建議每道菜味精添加量不應(yīng)超過(guò) 。 ? 溶解度 ? 可溶于水和酒精溶液，在水中隨溫度升高而增大；在酒精中隨酒精濃度升高而降低。人體中的谷氨酸能與血液中氨結(jié)合形成谷氨酰胺，從而解除組織代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的氨的毒害作用。 ? 草酰乙酸與乙酰 CoA在檸檬酸合成酶催化作用下，縮合成檸檬酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，檸檬酸在順烏頭酸酶的作用下生成異檸檬酸，異檸檬酸再在異檸檬酸脫氫酶的作用下生成 α酮戊二酸， α酮戊二酸是谷氨酸合成