【正文】 而形成雙鏈雜交分子的過(guò)程為雜交。如用地高辛標(biāo)記探針雜交后，需加入堿性磷酸酶聯(lián)結(jié)的抗地高辛抗體，再加入酶的底物來(lái)顯示雜交體。雜交的效率和特異性是優(yōu)化雜交條件的出發(fā)點(diǎn)，也是需要兼顧的兩個(gè)方面。 要進(jìn)行細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的離心分離，需先破碎細(xì)胞，通常用滲透壓休克、超聲振蕩或研磨等方法。在實(shí)際應(yīng)用中,不必分別測(cè)定這4個(gè)因素的具體數(shù)值,而是用沉降系數(shù)s (sedimentation coefficient)來(lái)表示顆粒沉降的參數(shù),即 2r2(ρpρM) s = 9η式中s為沉降系數(shù),它與顆粒直徑、顆粒密度、介質(zhì)密度和介質(zhì)粘度有關(guān),而介質(zhì)密度和粘度又是恒定的,因此s主要與顆粒的大小與密度有關(guān)，是表示顆粒大小和密度的參數(shù)。這種方法適用大小差別較大顆粒的分離，如各種細(xì)胞器的初步離心分離（圖29）。采用包括各種顆粒密度范圍的梯度介質(zhì)，把要分離的樣品放在密度梯度液表面或者混懸于梯度液中。常用的介質(zhì)有蔗糖、甘油等親水有機(jī)分子和氯化銫、硫酸銫等重金屬鹽。細(xì)胞器在每一步離心沉淀中的分布可隨離心速度和時(shí)間的不同而有一定差別。分析細(xì)胞學(xué)技術(shù)的發(fā)展有兩個(gè)主要領(lǐng)域，固定式細(xì)胞分析和流動(dòng)式細(xì)胞分析。（一）流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)與原理流式細(xì)胞儀的一般結(jié)構(gòu)可分為三個(gè)部分，細(xì)胞流動(dòng)室和液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；激發(fā)光源及其光束成形系統(tǒng)；細(xì)胞信號(hào)檢測(cè)和分析系統(tǒng)（圖2－10）。流式細(xì)胞儀的激發(fā)光源通常采用有多條可調(diào)諧的輸出譜線的氬離子氣體激光器，它能與多種熒光染料激發(fā)譜匹配。分選所得的細(xì)胞可以用玻片、試管、96孔板等進(jìn)行收集,結(jié)合分選后的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞圖像分析等結(jié)果，可以綜合單個(gè)細(xì)胞的更多信息，這是其他細(xì)胞學(xué)技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)的。（二）流式細(xì)胞術(shù)樣品制備流式細(xì)胞術(shù)要做高精度的單細(xì)胞定量分析，對(duì)細(xì)胞樣品的制備技術(shù)有著特殊的要求。流式細(xì)胞術(shù)所測(cè)的細(xì)胞樣品要求細(xì)胞呈單個(gè)分散狀態(tài)，其中細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞碎片盡可能少，分散過(guò)程中細(xì)胞的活性不受到明顯的損害，以保證下一步的熒光染色處理?，F(xiàn)在熒光探針已有幾千種，正確選擇熒光探針是首要工作。染料于組分的結(jié)合必須是特異性的，即染料、細(xì)胞組分結(jié)合物的光吸收是遵循朗伯比爾定律，而且染色深淺與被染細(xì)胞組分之間呈化學(xué)劑量學(xué)關(guān)系，符合這兩者關(guān)系的樣本就可應(yīng)用吸收測(cè)量法，通過(guò)光檢測(cè)器（可使光能變成電能）測(cè)量有色化合物吸收單色光的量。由于光強(qiáng)度比較容易測(cè)量，經(jīng)單色儀或干涉濾光片能得到單色光，顯微鏡近軸區(qū)的照射光近似于平行光，所以凡在涂片切片中含有吸光特性的物質(zhì),理論上均可采用吸收光度法測(cè)量。臺(tái)物在x方向和y方向上來(lái)回移動(dòng)，而測(cè)量光欄位置不動(dòng)，使臺(tái)上的被測(cè)物質(zhì)各小區(qū)域依序進(jìn)入測(cè)量光欄內(nèi)而被測(cè)量；也可用影象掃描，臺(tái)物不動(dòng)，測(cè)量光欄的象在臺(tái)物上沿x方向和y方向來(lái)回移動(dòng)，掃描測(cè)量重復(fù)性好，準(zhǔn)確性和靈敏度高，測(cè)量精度可達(dá)109g，可方便地進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)微結(jié)構(gòu)的分析，區(qū)分不同細(xì)胞類型的差別。熒光光度測(cè)量缺點(diǎn)是：熒光易衰減，有漂白作用，有時(shí)會(huì)猝滅，還必須減去本底熒光值。數(shù)字圖像運(yùn)算建立在數(shù)字矩陣基礎(chǔ)上，有許多基本處理功能和算法形式，與模擬圖像比較具有精度高，通用性強(qiáng)，再現(xiàn)性和靈活性好等優(yōu)點(diǎn)。圖像增強(qiáng)的方法很多，對(duì)比度增強(qiáng)可通過(guò)灰度變換，直方圖均衡等方式提高圖像的對(duì)比度和清晰度。 圖像二值化處理(image binary) 通過(guò)各種矩陣算子對(duì)二值圖進(jìn)行腐蝕膨脹，開(kāi)放封閉，填空洞，擦碎片，骨骼細(xì)化等形態(tài)學(xué)方法處理，也可采用布爾代數(shù)方法，進(jìn)行邏輯運(yùn)算，從而整理圖像畫(huà)面，清除不感興趣的對(duì)象，便于計(jì)算機(jī)。 圖像分析系統(tǒng)的核心部分是圖像分析處理軟件，分為通用軟件和專用軟件，它直接決定了分析結(jié)果的優(yōu)劣。數(shù)字圖像一般采用正多邊形點(diǎn)陣，最常用的是正方形點(diǎn)陣，如圖211所示。通過(guò)選取適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的譜線和寬度，可以做到高特異性的測(cè)量，通常顯微分光光度計(jì)選用適當(dāng)?shù)恼瓗V色片來(lái)獲取所需熒光波長(zhǎng)，高精度的顯微分光光度計(jì)采用光柵單色儀，可獲得5nm帶寬的激發(fā)波長(zhǎng)和檢測(cè)波長(zhǎng)。掃描法根據(jù)不同掃描方式可分為：飛點(diǎn)掃描、像掃描、物掃描、TV掃描等。C常用測(cè)量方法有顯微熒光光度術(shù)（Microfluorometry）、顯微密度術(shù)（Microdensitometry）、細(xì)胞光度術(shù)（Cytophotometry）顯微反射光度測(cè)量及波長(zhǎng)掃描測(cè)量等。熒光細(xì)胞化學(xué)過(guò)程要求有足夠的特異性，即所用熒光染料與所感興趣的細(xì)胞成份是否為特異性結(jié)合，嚴(yán)格控制各種反應(yīng)條件是保證反應(yīng)特異性的重要因素。（3） 石臘包埋組織單細(xì)胞懸液的制備，可使大量存檔的臨床資料重新得到研究與利用，從而擴(kuò)大了流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍。由于每一種熒光分子結(jié)構(gòu)不同，考慮熒光激發(fā)譜與熒光發(fā)射譜的接受時(shí)，通常要注意選擇合適的激發(fā)光源和各類分束濾色片。帶正電荷的液滴偏向負(fù)極，帶負(fù)電荷的液滴偏向正極。流動(dòng)室是流式細(xì)胞儀的核心部件，它采用液體動(dòng)力學(xué)分層鞘流技術(shù)，層流技術(shù)保證樣品中的每一細(xì)胞都沿流動(dòng)室的中心軸運(yùn)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)了每一細(xì)胞以相同的速度、相同方向、相同的軌跡逐個(gè)依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)，流動(dòng)室也可稱為單細(xì)胞流發(fā)生器。一、流式細(xì)胞分析技術(shù) 流式細(xì)胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM ）從原理上講是一種在計(jì)算機(jī)技術(shù)支持下的高度自動(dòng)化的細(xì)胞顯微熒光脈沖分光光度儀，它是結(jié)合激光技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、數(shù)字計(jì)算機(jī)技術(shù)和熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的產(chǎn)物，是分析細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域的重要儀器。目前有關(guān)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)與功能以及細(xì)胞中的重要反應(yīng)過(guò)程的資料，如蛋白質(zhì)合成機(jī)制、蛋白質(zhì)分選和運(yùn)輸?shù)龋胁簧賮?lái)自分離細(xì)胞器的生化分析和無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)。 （2）細(xì)胞器的初步分離 用差速離心法分離各種細(xì)胞器。另外，不同方法的特點(diǎn)也是考慮的因素，如差速離心法離心時(shí)間比等密度離心法短，而且所用介質(zhì)濃度也比較低，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的損傷和抽提都比較小，因此適用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的分析分離；而等密度離心法在一定體積的介質(zhì)中可以分離較多的細(xì)胞成分，適用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的制備分離。 等密度離心法等密度離心法（isodensity centrifugation） 根據(jù)Stokes公式，當(dāng)顆粒密度（ρp）等于介質(zhì)密度（ρM）時(shí)，離心時(shí)顆粒懸浮于介質(zhì)中不移動(dòng)。先在低速離心條件下把大的顆粒沉降到管底，其它顆粒留在上清液中；然后以較高的速度離心，把較大的顆粒沉淀于管底。這一基本原理是差速離心和等密度區(qū)帶離心方法的主要依據(jù)。用這一技術(shù)可以獲得相對(duì)純凈的各種細(xì)胞器和大分子顆粒。冷凍切片能較好的保存靶核酸因而較易獲得雜交信號(hào)，但對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保存較差。⑵ 免疫細(xì)胞化學(xué) 對(duì)于非同位素標(biāo)記的探針，可根據(jù)免疫細(xì)胞化學(xué)原理用直接法或間接法將探針標(biāo)記物顯示出來(lái)。通常標(biāo)記物被導(dǎo)入某個(gè)單核苷酸而形成標(biāo)記分子，如四甲基羅達(dá)明UTP、生物素UTP、地高辛dUTP等。分子雜交是堿基互補(bǔ)的兩條異質(zhì)核酸單鏈在一定條件下締合形成雙鏈分子的過(guò)程。 顯影和定影 經(jīng)過(guò)帶電粒子作用而在核子乳膠的鹵化銀晶體中所產(chǎn)生的潛影，必須經(jīng)過(guò)顯影和定影才能把“像”顯示出來(lái)。方法是給動(dòng)物注射示蹤化合物，或?qū)ε囵B(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)液中加入示蹤化合物。β射線具有較大的穿透本領(lǐng)和較小的電離作用，在放射自顯影技術(shù)中有重要意義，在組成生物大分子的主要元素中都有發(fā)射β射線的核素如3H、32P、33P和35S等，是放射自顯影的重要工具。放射自顯影技術(shù)有光鏡和電鏡兩個(gè)層次。這種方法因?yàn)樵诘谝豢贵w上可以結(jié)合多個(gè)標(biāo)記的第二抗體，所以其靈敏度比直接法更高（圖2－6）圖2－6 間接法檢測(cè)抗原示意圖 參照前書(shū)圖25 （二）實(shí)驗(yàn)方法 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法包括標(biāo)記抗體的準(zhǔn)備、組織樣品的制備及免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)。常用的標(biāo)記酶如辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase）與其底物H2O2和氨基聯(lián)苯胺相遇時(shí)，形成的棕色沉淀可在光鏡下觀察到，遇鋨酸反應(yīng)后形成鋨黑電鏡下呈高電子密度。當(dāng)這一重組DNA在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，可以因?yàn)楹刑禺惪乖虬肟乖嚯?，而能用免疫?xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)到，因而重組蛋白質(zhì)也就能在同處被檢測(cè)到。它包括光鏡水平（簡(jiǎn)稱免疫組化）和電鏡水平(簡(jiǎn)稱免疫電鏡)的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。在生物化學(xué)中，酶被分成水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、裂合酶、合成酶和異構(gòu)酶六大類。 （一）酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的原理 顯微鏡下無(wú)法直接觀察到細(xì)胞內(nèi)的酶，通過(guò)酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)才能間接地反應(yīng)酶的存在位置。近年來(lái)，在其他方面也展開(kāi)了積極的才探索，如將AFM用于研究生物大分子之間的相互作用、研究生物結(jié)構(gòu)的納米操作、研究活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能以及用于醫(yī)學(xué)和藥物學(xué)研究等。通過(guò)檢測(cè)微懸臂背面反射出的激光光點(diǎn)在光學(xué)檢測(cè)器上的位置變化，可以轉(zhuǎn)換成力的變化，因?yàn)榉瓷涔恻c(diǎn)的位置變化或微懸臂彎曲變化與力的變化成正比。通過(guò)記錄隧道電流的變化就可以獲得樣品表面的微觀信息。所以多采用液體CO2臨界點(diǎn)干燥法，在臨界狀態(tài)時(shí)表面張力系數(shù)為零，也就是分子的內(nèi)聚力等于零時(shí)干燥，細(xì)胞不再收縮，保持了原有的形態(tài)。負(fù)染色技術(shù)主要用于細(xì)菌、病毒、噬菌體等微生物大分子結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞碎片以及分離的細(xì)胞器等研究工作。由于電子束穿透能力的限制透射電鏡觀察的樣品必須很薄，普通光鏡切片厚度約3～5181。從而獲知結(jié)構(gòu)變化與其組成的元素變化的關(guān)系，它的分辨率很高，元素周期表上大部分元素都能分辨出來(lái)。電子探針受掃描發(fā)生器控制，在樣品表面進(jìn)行逐點(diǎn)掃描，把樣品表面的原子外層的電子擊出，形成二次電子，二次電子被二次電子檢測(cè)器收集、轉(zhuǎn)換、放大、轉(zhuǎn)換到顯象管，由于顯象管的熒光屏上的畫(huà)面與樣品被電子束照射面呈嚴(yán)格同步掃描，逐點(diǎn)逐行一一對(duì)應(yīng)，這樣就能看出樣品表面形貌。成像系統(tǒng)的總放大倍率是物鏡、中間鏡和投影鏡放大倍數(shù)的乘積。 透射電子顯微電鏡 透射電子顯微電鏡（transmmision electron microscope），是發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的電鏡，一般所說(shuō)的電鏡指的便是透射電鏡。第一臺(tái)電鏡誕生于1931年，至今已有70余年的歷史，經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)和提高已從最初的一種電鏡發(fā)展為多種電鏡，分辨率可達(dá)到1197。 圖22 激光掃描共焦顯微鏡物像共軛原理圖參照前書(shū)圖22LSCM最常用的功能是熒光檢測(cè)、三維重建和顯微操作等。LSCM的光源為激光，是單色性好的平行光，基本消色差，成象聚焦后焦深小，縱向分辨率高，可無(wú)損傷地對(duì)樣品作不同深度的層掃描和熒光強(qiáng)度測(cè)量。微分干涉顯微鏡能使細(xì)胞核及較大的細(xì)胞器如線粒體等具有較強(qiáng)的立體感，比較適合于顯微操作。相差顯微鏡能夠改變直射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變成振幅差（明暗差），同時(shí)它還吸收部分直射光線以增大其明暗反差。熒光顯微鏡一般采用高壓汞燈和弧光燈作為光源，在光源和反光鏡之間放一組濾色片以產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，光譜一般從紫外到紅外，從而激發(fā)各種熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的發(fā)射光。在細(xì)胞生物學(xué)中常用的有普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、相差顯微鏡，以及暗視野顯微鏡和微分干涉差顯微鏡。當(dāng)物體直徑小于200nm（）就分辨不清。20世紀(jì)80年代IBM蘇黎世實(shí)驗(yàn)室的Binning等人發(fā)明了掃描隧道顯微鏡， 左右，可直接觀察DNA、RNA等生物大分子及生物膜等結(jié)構(gòu)。電子顯微鏡下則可以觀察到這些光學(xué)顯微鏡下看不到的結(jié)構(gòu)，稱為細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopic structure）。第二章 細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展是與實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步密切相關(guān)的，細(xì)胞生物學(xué)的每一個(gè)重大進(jìn)展都是由于引入了新的研究技術(shù)的結(jié)果。在光學(xué)顯微鏡下看到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)稱為細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)（microscopic structure），由于受到分辨率的限制，如生物膜、細(xì)胞骨架和一些細(xì)胞器等。20世紀(jì)30年代，德國(guó)的Ruska發(fā)明了電子顯微鏡，突破了光鏡的局限，其分辨率可達(dá)2nm左右，使人們對(duì)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)逐步深入到超微觀世界。這是由于光波具有衍射現(xiàn)象，當(dāng)光波波長(zhǎng)大于物體二倍時(shí)，光波能繞過(guò)物體前進(jìn)，就像沒(méi)有遇到物體一樣，所以在光鏡下看不清直徑小于波長(zhǎng)一半的物體。目前光學(xué)顯微鏡已發(fā)展成多種類型，用于各類不同的研究目的。 （二）熒光顯微鏡技術(shù)熒光顯微鏡（fluorescent microscope）是以各種特定波長(zhǎng)光源激發(fā)生物標(biāo)本中的熒光物質(zhì)，產(chǎn)生各種可見(jiàn)顏色熒光的一種顯微鏡。(三)相差顯微鏡技術(shù) 相差顯微鏡（phase contrast microscope）是一種可以觀察活細(xì)胞或未經(jīng)染色的標(biāo)本的顯微鏡。微分干涉差顯微鏡利用的是偏振光，這些光經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時(shí)間經(jīng)過(guò)樣品的相鄰部位，然后在經(jīng)過(guò)另一棱鏡將這兩束光匯合，從樣品中厚度上的微小區(qū)別就會(huì)轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差并且具有很強(qiáng)的立體感。與普通光鏡和熒光顯微鏡相比有一些明顯的優(yōu)點(diǎn)，其中主要有：（1）普通顯微鏡使用的光源為鹵素?zé)?，光譜范圍寬，成象時(shí)樣品上每個(gè)照光點(diǎn)均會(huì)受到色差影響以及由照射光引起的散射和衍射的干擾，影響成象質(zhì)量。（3）LSCM的高靈敏度、高分辨率和高放大倍數(shù)，減少了光淬滅的影響，提供了普通光學(xué)顯微鏡無(wú)法顯示的結(jié)構(gòu)信息，并適用于達(dá)到毫秒級(jí)的快速變化檢測(cè)。它包括普通樣品制備技術(shù)（如超薄切片技術(shù)）和特殊樣品制備技術(shù)（如電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)）。主要分為透射電子顯微電鏡、掃描電子顯微電鏡、分析電子顯微鏡和高壓電子顯微鏡。成像系統(tǒng)由樣品室、物鏡、中間鏡和投影鏡組成，是電鏡具有高放大倍率和高分辨率的關(guān)鍵部位，主要是借助改變各個(gè)透鏡的電流來(lái)獲得不同的放大倍率。掃描電鏡的光源部分與透射電鏡相同，是由電子槍產(chǎn)生電子射線經(jīng)聚光鏡聚焦形成一束極細(xì)的光斑稱為電子探針（electron probe）。利用分析電鏡可以在觀察樣品形貌的同時(shí)了解微小區(qū)域（如某一細(xì)微結(jié)構(gòu)）內(nèi)所含元素的種類及其含量，在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平上對(duì)其內(nèi)部的化學(xué)元素成分進(jìn)行定位、定性、定量分析。 超薄切片技術(shù) 超薄切片技術(shù)（ultramicrotomy）是透射電鏡樣品制備方法中最基本的一種。常用的重金屬有磷鎢酸鈉、醋酸鈾等。由于生物樣品柔軟多水