【正文】 常見 問題、原因分析及其對策 DNA提取的基本步驟 －內(nèi)容物釋放 、純化 ，并去除雜質(zhì) 材料準(zhǔn)備 ? 最好使用新鮮材料， 低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融 ? 提取血液基因組 DNA時，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞） ? 組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成 DNA降解 ? 含病毒的液體材料 DNA含量較少，提取前先富集 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 ? 使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加） ? 培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失 ? 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量 ? 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失） 細(xì)胞裂解 ? 材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致 DNA量少，純度低 ? 針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式： ? 植物材料－－液氮研磨 ? 動物組織－－勻漿或液氮研磨 ? 組培細(xì)胞－－蛋白酶 K ? 細(xì)菌－－溶菌酶破壁 ? 酵母－－破壁酶或玻璃珠 ? 高溫溫浴時，定時輕柔振蕩 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 ? 菌體量適當(dāng) ? 培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮 ? 變性的時間不要過長（ 5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷 ? 復(fù)性時間也不宜過長，否則會有基因組 DNA的污染 ? G＋ 菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁 核酸分離、純化 ? 采用吸附材料吸附的方式分離 DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系 ? 采用有機(jī)（酚 /氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔 ? 離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間 ? 針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 核酸分離、純化 ?蛋白質(zhì)的去除： ? 酚 /氯仿抽提 ? 使用變性劑變性（ SDS、異硫氰酸胍等） ? 高鹽洗滌 ? 蛋白酶處理 ?多糖的去除： ? 高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入 1/2體積的 5M NaCl，高鹽可溶解多糖。 ? 有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈 RNA。 乙酸鈉（ ）：維持變性的細(xì)胞裂解液的 pH值，沉淀 RNA。期間動作快速，樣品保持冷凍 ? 樣品量適當(dāng)，保證充分裂解 ? 為減少 DNA污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量 提取的因素? 純化： ? 在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速； ? 經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時間長，易造成 RNA 降解； ? 柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。 ? 解決辦法 :重新抽提一次 ， 再沉淀 ， 溶解 。 ? 變性電泳條帶變淡： ? EB 與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些； ? 甲醛的質(zhì)量不高 。 用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低 。 ? 減少起始樣品量 ， 確保裂解完全 、 徹底 ? 解決辦法 :重新抽提一次 ， 再沉淀 ， 溶解 。 RNA提取的通用方法 影響 RNA提取的因素 ? 材料 ： ? 新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料 ? 如若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間隔。 ? 洗滌： 70％乙醇。 對 策 原因 1. 實驗材料不佳或量少 2. 破壁或裂解不充分 3. 沉淀不完全 4. 洗滌時 DNA丟失 1. 盡量選用新鮮（幼嫩）的材料 2. 動植物要勻漿研磨充分； G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁 3. 高溫裂解時，時間適當(dāng)延長（對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增加 PK的用量） 4. 低溫沉淀，延長沉淀時間 5. 加輔助物，促進(jìn)沉淀 6. 洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒 DNA提取常見問題 ?問題三： DNA提取量少。 有時還會出現(xiàn)三條帶 ， 其中一條是因為有一些質(zhì)粒 DNA在提取過程中遭到損傷而線性化 ， 其移動速度介于螺旋狀和超螺旋狀質(zhì)粒 DNA之間 ， 所以該條電泳帶位于上述兩種帶之間 。電泳溫度視需要而定，對大分子的分離，以低溫較好，也可在室溫下進(jìn)行。 室溫下靜置 30min左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。） 大豆線粒體 DNA的提取 線粒體 DNA的檢測 （ 1）電泳檢測 取 1μl 所得的 mtDNA溶液加 1μL 溴酚藍(lán)，行 %瓊脂糖凝膠電泳，以 λDNA （ 50ng）作對照，于 70V穩(wěn)壓電泳 90min（待溴酚藍(lán)行至離前端 2cm左右），在紫外燈下觀察。 2）將濾液以 1000g，離心 10min，收取上清，再經(jīng) 17000g，離心 15 min。應(yīng)按 13條帶計算，因為 3kb的量是其它片段量的近三倍）： 片段 堿基對 質(zhì)量 1 10,002 42 ng 2 8,001 42 ng 3 6,001 50 ng 4 5,001 42 ng 5 4,001 33 ng 6 3,001 125 ng 7 2,000 48 ng 8 1,500 36 ng 9 1,000 42 ng 10a 517 42 ng* 10b 500 42 ng* 的條帶由 500bp和 517bp組成，這樣即使在低分子量區(qū)域條帶的強(qiáng)度也比較均一。 3. 加入 DNA稀釋液 ， 測定 260nm 及 280nm的吸收值 。 3. 加入 200?l新配制的 +1％ SDS（ 變性液 ） ， 加蓋顛倒 67次使之混勻 ， 冰上放置 5min。 快捷高效。 4℃ 10000rpm離心 10min。 組份 TrisHCl （ ） EDTA （ pH ） NaCl SDS 終濃度 10 mM 20 mM 2% ? SDS法 DNA提取緩沖液 ? SDS法流程圖 （以動物組織為例） 動物組織 細(xì)胞裂解 上層溶液 組織勻漿 抽提 干燥溶解 離心洗滌 酒精沉淀 DNA溶液 基因組 DNA－ SDS法 ? SDS法實例 取 ，置液氮中研磨成粉。 分別用 70%、 80%酒精洗滌沉淀。 ? 該復(fù)合物在高鹽溶液中（ ）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。 基因組 DNA－ CTAB法 基因組 DNA－ CTAB法 十六烷基三甲基溴化銨 ? CTAB法流程圖 植物材料 裂解液 上層溶液 液氮研磨 抽提 細(xì)胞裂解 干燥溶解 離心洗滌 酒精沉淀 DNA溶液 基因組 DNA－ CTAB法 ? CTAB法實例 65℃ 預(yù)熱。 加入等體積的氯仿 /異戊醇 （ 24： 1）抽提 13次。 4℃ 120