堿裂解法從ecoli中制備質(zhì)粒dna(存儲(chǔ)版)
【正文】 另一常用的抗藥性基因?yàn)樗沫h(huán)素抗性(tetracycline resistance， tetr)基因，該基因編碼一種含 399氨基酸殘基的膜相關(guān)蛋白質(zhì)，能阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。核苷酸的序次號(hào)，以 EcoRI序列 GAATTC的第一個(gè) T為第一個(gè)核苷酸。 而且細(xì)菌量的減少 ， 使得裂解物的復(fù)雜性和粘稠度降低 ， 操作更方便 、 有效 ， 對(duì)煮沸法更是如此 。 ? 但是由于此法費(fèi)用昂貴及流程長(zhǎng)，近年來(lái)，發(fā)展了幾種不同的方法取代了超離法。 細(xì)菌懸浮液中含有10%蔗糖以提高溶液的滲透壓 ， 減輕細(xì)菌裂解時(shí) DNA泄漏過(guò)快產(chǎn)生的機(jī)械剪切力 。 4．細(xì)菌的培養(yǎng)與收集 ? 細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝廢物和脫落的細(xì)胞壁成分，也會(huì)影響到質(zhì)粒的質(zhì)量和內(nèi)切酶酶解效果。如果依然存在 ， 可用離心柱層析法純化ＤＮＡ 。 問(wèn)題： ? １ ） 有些工作者首次進(jìn)行小量制備時(shí) ，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒ＤＮＡ不能被限制酶所切割 ， 這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意得不夠 。 ? 1966年 Vinograd等人對(duì)這個(gè)問(wèn)題作過(guò)報(bào)道 ， 但目前 ， 仍有些實(shí)驗(yàn)人員 ， 對(duì)這一關(guān)鍵問(wèn)題并沒(méi)有足夠的重視 。 ? 另外 ， HB101及其它含有 endA+基因型的菌株表達(dá)中的核酸內(nèi)切酶 A， 在煮沸時(shí)不能完全失活 ， 在以后操作中 ，只要有 Mg2+存在 (如內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液 )，核酸內(nèi)切酶 A就可將質(zhì)粒 DNA降解 ， 而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 。 3．質(zhì)粒 DNA純化 ? 質(zhì)粒從細(xì)菌中分離出來(lái)以后，為滿足有些實(shí)驗(yàn)的要求還應(yīng)進(jìn)一步純化。 ? 對(duì)于新一代的質(zhì)粒如 pUC系列等，由于宿主對(duì)這些松弛型質(zhì)粒的復(fù)制控制不嚴(yán)，利用氯霉素對(duì)質(zhì)粒 DNA的選擇性擴(kuò)增并不十分必要。 ? 若這種單一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)處于選擇標(biāo)記基因的內(nèi)部，外源基因片斷插入后會(huì)導(dǎo)致該基因失活便于篩選。 5. 選擇的標(biāo)記 ? 質(zhì)粒應(yīng)帶有一個(gè)或幾個(gè)可供選擇的標(biāo)記，便于對(duì)轉(zhuǎn)化株的篩選。 ? 由于質(zhì)粒分子是從細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒庫(kù)中隨機(jī)選取出來(lái)進(jìn)行復(fù)制的 ， 所以兩個(gè)不同的質(zhì)粒在一個(gè)單細(xì)胞中的拷貝數(shù)并不總能保持相同 。 通常 ， 質(zhì)粒含有編碼某些酶的基因 ， 這些酶事實(shí)上在一定的環(huán)境下對(duì)細(xì)菌宿主有利 。 ? 已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒 . ? 這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位 。 2. 含有高效的自主復(fù)制成分 ? 質(zhì)粒的復(fù)制與宿主細(xì)胞的繁殖不相關(guān)，在抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成時(shí)，細(xì)菌染色體 DNA停止復(fù)制，但這種質(zhì)?？衫^續(xù)利用細(xì)菌原有
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