【正文】 E1. (D) The product contains two headtotail repeats of the original gene， with the RE1 and RE2 sites maintained only at the ends of the gene. (E) Additional rounds of RDL proceed identically， using products from previous rounds as starting materials[13]. 類彈性蛋白多肽的應(yīng)用 在純化蛋白方面的應(yīng)用 ELPs 的應(yīng)用目前研究最多的是在純化蛋白質(zhì)方面?；蛑亟M合成法更是由于 RDL(recursive directional ligation， RDL)技術(shù) [13]的使用而被推向新的高度，其原理如圖 1 所示。因而，如果 ELPs鏈比較短時(shí)，就降低了聚合物鏈內(nèi)部疏水性相互作用的效率，所以絮集作用就受抑制。C，這是因?yàn)? ELPs–[KV2F]家族的賴氨酸含量比 ELPs–[KV7F]家族高 2倍以上。在相變發(fā)生時(shí)，增加溫度會使在水環(huán)境中的聚合物有序性得到加強(qiáng)，而包圍在疏水性殘基的有序水分子變成無序狀態(tài)，此時(shí)疏水性基團(tuán)將與水溶液相分離，結(jié)果在整個(gè)變化過程中是趨于無序性的，這與熱力學(xué)第二定律相吻合 [1011]。其結(jié)構(gòu)主要由五肽重復(fù)序列單元構(gòu)成，即（ ValProGlyXaaGly, VPGXG），源自于彈性蛋白的疏水區(qū)域，其中 Xaa 可以是除 Pro 以外任一氨基酸 [1]。 通過分析，推斷疏水作用與結(jié)合水的減少在 ELP[KV8F20]的相變過程中起到關(guān)鍵作用。將偽氨基酸組成中的的相關(guān)系數(shù)部分作為類彈性蛋白的特征向量，從類彈性蛋白序列出發(fā)，利用最小中位方差回歸，找出其序列相關(guān)系數(shù)的最佳階數(shù)。論文寫作中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究內(nèi)容，如參考他人或集體的科研成果，均在論文中以明確的方式說明。M ELP[KV8F20]相 變溫度降低至 19℃，此 ELPs 序列有望開發(fā)成一新型純化標(biāo)簽，為今后重組蛋白的非色譜分離純化奠定基礎(chǔ)?？偨Y(jié)了相關(guān)結(jié)論，這可為今后利用 ELPs 純化重組蛋白提供經(jīng)驗(yàn)積累和理論依據(jù)。 利用類彈性蛋白的可逆相變特性 ,使其在蛋白純化、作為藥物載體、組織工程等方面得到廣泛的應(yīng)用 [2] 類彈性蛋白多肽的相變機(jī)理 相變過程是 ELPs在水溶液中絮聚的過 程，伴有伸展型多肽鏈的瓦解并與溶液相分離 [34]。當(dāng)五肽重復(fù)序列次數(shù)較少時(shí)， ELPs的 tT 隨重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)的增加而下降較明顯，當(dāng)五肽重復(fù)序列 次數(shù)較大時(shí)， ELPs的 tT 隨重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)的增加，其值變化不大。然而，這種影響效應(yīng)會隨著 ELPs分子中帶電氨基酸的不同而變化，在溶解液中， ELPs的 tT 的離子效應(yīng)遵循 霍夫邁斯特離子 序(Hofmeister series)。 其它與 Tt有關(guān)的因素 ELPs[KV2F8] 和 ELPs[KV7F9]，分別只有 40和 45個(gè)氨基酸，是到目前為止最短的 ELPs純化標(biāo)簽，這兩種 ELPs（ free ELPs）是不能通過反相轉(zhuǎn)換循環(huán) (Inverse 華僑大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文 4 transition cycling ITC)純化出來，但這兩種 ELPs的融合蛋 白是可以通過 ITC被提純的，因?yàn)? ELPs的融合蛋白的 tT 比純粹的 ELPs（ free ELPs）的 tT 低 [14]。 圖 RDL 技術(shù)的分子生物學(xué)步驟 [13] The molecular biology steps of RDL[13] 華僑大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文 5 （續(xù)圖 ）（ A）人工合成的 ELPs 單體基因插入到克隆載體中。 表 五種純化方法成本比較 Tabl e The cost of five purification methods 項(xiàng)目 pMAL fusion w/tag removal Histag w/ tag removal IMPACTCN PHB 純化體系 ELPs 純化體系 常規(guī)產(chǎn)量 40 Mg/L 74 Mg/L Mg/L 36 Mg/ 85 Mg/L 樹脂吸附力 3 Mg/ml 8 Mg/ml 2 Mg/ml — — 生長培養(yǎng)基 ＄ 44, ＄ 23, ＄ 379， 894 ＄ 123,257 ＄ 58,699 誘導(dǎo)成本 ＄ 35, ＄ 19, ＄ 314, ＄ 39, — 緩沖成本 ＄ 51, ＄ 5, ＄ ＄ 27， ＄ 15,810 樹脂成本 ＄ 624, ＄ 790, ＄ 192,000 — — 復(fù)性成本 ＄ 428, — — — — 蛋白酶成本 ＄ 8,480, — — — — 總計(jì) ＄ 9,664, ＄ 838, ＄ 989,606 ＄ 153,470 ＄ 74,509 對于大規(guī)模生產(chǎn)融合蛋白及高通量生產(chǎn)多肽的蛋白質(zhì)組學(xué)研究來說，發(fā)展一種華僑大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文 6 簡單且可 靠的純化方式是一個(gè)重要目標(biāo)。 組織工程是一跨學(xué)科的領(lǐng)域，它覆蓋了細(xì)胞工程材料和相關(guān) 的生物化學(xué)方面的知識與技術(shù)，其目標(biāo)是創(chuàng)造出人工器官組織或再生受損的組織，因此它可幫助成千上萬患者擺脫組織損傷與組織喪失的困擾 [21]。在基因水平上可對 ELPs 進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)， ELPs 可被設(shè)計(jì)成在室溫下成液體狀，當(dāng)注射物的溫度增加到一定范圍時(shí)， ELPs 可以形成膠狀物質(zhì)，還可在基因水平上對多化學(xué)物理耦連位點(diǎn)進(jìn)行控制，這樣可使 ELPs 形成網(wǎng)狀物，其反應(yīng)活性位點(diǎn)可設(shè)計(jì)為可控降解，添加特定 的配體可以促進(jìn)細(xì)胞的固定與組織的生長[2]。 Annabi [28]等以戊二醛為交聯(lián)介質(zhì)以及高濃度的 CO2，制作出的 ELPs 水凝膠在孔徑大小與機(jī)械性能均能得到較大改善。把 ELPs 作為藥物的載體，具有如下優(yōu)勢： ELPs 是生物大分子，具有良好的生物相容性、無毒、可在體內(nèi)自然降解、可增加藥物的溶解性、能有效延長藥物的半衰期、減少藥物的毒理作用、定向在腫瘤部位累積 [3537]； ELPs 序列長度以及氨基酸組成可在基因水平上進(jìn)行精確控制；與 ELPs 融合表達(dá)的藥物蛋白可以通過可逆熱循 環(huán) (inverse thermal cycling， ITC)直接純化出來，因?yàn)榛? ELPs 融合蛋白也有相變溫度特性；采用 ELPs作為為藥物載體可以直接將載體與藥物注射到體內(nèi)；無需尋找病害部位 [2]。產(chǎn)生這種納米微粒是把 ELPs 和藥物共溶于有機(jī)溶劑中，然后加速通過電壓梯度，在傳輸過程中，由于受蒸發(fā)作用，最終在靶面上可收集到藥物微粒。運(yùn)行模擬是為了分析分子中所有原子在微觀上的相互作用關(guān)系與特性，并從中分析出相應(yīng)的宏觀性質(zhì) [44]。利用 ELPs 融合蛋白也具有可逆相變的特性，使用采用 ITC（ inverse transition cycling）純化 ELPs 的重組蛋白具有簡單、快速等優(yōu)點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)材料 數(shù)據(jù)來源與預(yù)測工具 試驗(yàn)數(shù)據(jù)來源 文中所用的數(shù)據(jù)取自于 Olson S D 的博士論文 [48]，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)表格中所涉及到的參變量有 ELPs 的分子量 (MW)、 ELP 每一單體的 Xaa 數(shù)量 (Kperiod)、 ELPs 的濃度([ELP])。 為了定量比較擬合和測試效果，特定義以下三個(gè)特征指標(biāo) : (1)平均絕對百分比誤差：1||1 ||n t tt tyyM P A E ny???? ? （ 2）均方根誤差： 211 ()n tiM S E y yn????? （ 3）平均絕對誤差：11 ||n tttM A E y yn????? 式中， ty 和 ty? 分別表示實(shí)際值和擬合值 (或預(yù)測值 ) 。而 ELPs 濃度對 ELPs 相變溫度沒有影響，故為相關(guān)系數(shù)零。 圖 ：使用支持向量機(jī)獲得的預(yù)測值與實(shí)測值關(guān)系 Fig2: Relationship between experimental and predicted transition temperature obtained by SVM 華僑大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文 15 利用神經(jīng)網(wǎng) 絡(luò)預(yù)測相變溫度 對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)而言，由于訓(xùn)練樣本集的大小有限，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練后對訓(xùn)練集外的輸入的響應(yīng)如何，直接決定了網(wǎng)絡(luò)的性能。 與傳統(tǒng)的擬合方法預(yù)測 ELPs 的相變溫度相比，基于支持向量機(jī)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對相變溫度進(jìn)行預(yù)測，不用通過預(yù)測相變溫度具體形式，直接從數(shù)據(jù)中得到相變溫度與ELPs 序列、分子量、 Xaa 組成、 濃度之間的關(guān)系，同時(shí)加以一定的先驗(yàn)知識，能夠更大范圍地反應(yīng)它們之間的關(guān)系，其應(yīng)用的范圍也更廣闊。 表達(dá)載體及宿主的選擇 圖 pET表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中的表達(dá)原理示意圖 Expression principle of pET expression system in 本研究采用質(zhì)粒 pET22b(+)構(gòu)建表達(dá)載體 pET22bELPs， pET22b(+)質(zhì)粒載體具有氨芐青霉素抗性 (Ampr)。本章通過設(shè)計(jì)一新型 ELPs 純化標(biāo)簽，具有更低的相變溫度及對鹽更敏感，有望開發(fā)成純化標(biāo)簽。在 9 組驗(yàn)證中，采用默認(rèn)參數(shù)獲得的特征值最好，即隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)為 6，學(xué)習(xí)速率為 ，動態(tài)參數(shù)為 時(shí)，其準(zhǔn)確率最高，其MAE、 MSE 及 MPAE 均最小，分別為 、 和 。 利用支持向量機(jī)預(yù)測相變溫度 如前所述， ? =8 為氨基酸相關(guān)系數(shù)的階數(shù)最佳運(yùn)行參數(shù)，利用 UD 對支持向量機(jī)運(yùn)行參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)交叉驗(yàn)證后，其結(jié)果如表 所示： 表 ：支持向量機(jī)運(yùn)行參數(shù)的選擇 Table : Selection of running parameters of SVM Number C epsilon Gamma MAE MSE MPAE R1 10 5 R2 1 R3 R4 1 R5 50000 R6 華僑大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文 14 R7 100 R8 10000 R9 50 R10 R11 R12 5 R13 500 1 R14 5000 R15 1000 default 1 由表 可得出，三個(gè)誤差特征指標(biāo)在交叉驗(yàn)證中變化的幅度較小，這說明 SVM對運(yùn)行的參數(shù)不是很敏感。使用的 PC為 DELL precisionTM490。 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是由大量的神經(jīng)元廣泛互連而成的網(wǎng)絡(luò)，是模擬人在思維時(shí)神經(jīng)元的工作原理而形成的一個(gè)非線性的動力系統(tǒng)， BP 網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)采用梯度下降算法，使得網(wǎng)絡(luò)的實(shí)際輸出與期望輸出的均方差極小化，且具有自適應(yīng)機(jī)制，通過訓(xùn)練和學(xué)習(xí)，達(dá)到對知識進(jìn)行分類、模式判別、聯(lián)想記憶等能力 [52]。在這之前， Urry 等認(rèn)為， tT 是關(guān)于 ELPs 序列、多肽鏈長度、 Xaa 種類及 mole fraction 的函數(shù) [47]， 然而， Chilkoti 等 [16]認(rèn)為 Urry 等合成的 ELPs 大多是依賴于化學(xué)法，因而 ELPs 的長度就不能得到精確控制，故不能很好地描述 ELPs 序列，鏈長及濃度與 tT 的內(nèi)在關(guān)系。模擬結(jié)果分析主要分析了RMSD 值、氫鍵等，通過這些結(jié) 果推測 ELPs 的熱穩(wěn)定性及分析 ELPs 相變機(jī)理。 動力學(xué)模擬方法的應(yīng)用 分子動力學(xué)是一套分子模擬方法，該方法主要是依靠牛頓力學(xué)來模擬分子體系的運(yùn)動，以在由分子體系的不同狀態(tài)構(gòu)成的系綜中抽取樣本，從而計(jì)算體系的構(gòu)型積分，并以構(gòu)型積分的結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)一步計(jì)算體系的熱力學(xué)量和其他宏觀性質(zhì)。直徑更大的微?？梢酝ㄟ^直徑為微米級別的微粒進(jìn)行可逆的形成。 ELPs 在藥物載體上的應(yīng)用 在靶向腫瘤上應(yīng)用 很多理療實(shí)驗(yàn)在體外顯示出有很高活性，但在體內(nèi)效果卻很低，這往往是由于藥物在運(yùn)輸過程導(dǎo)致的 [30]。 Lim 等 [25]設(shè)計(jì)合成了能在水溶液中快速交聯(lián)的 ELPs 多嵌塊共聚物（ block copolymers），結(jié)果表明植入到 ELPs 水凝膠的纖維原細(xì)胞至