【正文】 辯小組成員評分用表，評分標(biāo)準(zhǔn)參照《河北農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文質(zhì)量評定參考標(biāo)準(zhǔn)》 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2020 屆本科畢業(yè)論文答辯記錄表 所在學(xué)院：農(nóng)學(xué)院 專業(yè)班級： 農(nóng)學(xué) 0902 時間： 2020 年 6 月 6 日 學(xué) 生 姓 名 劉通 學(xué) 號 2020014010216 指導(dǎo)教師姓名 張艷 職 稱 講師 畢業(yè)論文題目： 海島棉抗黃萎病相關(guān)基因 GbEDS1 的克隆與生物信息學(xué)分析 答 辯 小 組 成 員 姓 名 職 稱 成 績 姓 名 職 稱 成 績 王省芬 教授 李志坤 副教授 劉立峰 教授 李喜煥 副教授 李文龍 講師 答辯小組評語： 答辯小組組長：（簽字） 2020年 6 月 6 日 答 辯 成 績： 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 本科畢業(yè)論文 (設(shè)計 ) 題 目： 海島棉抗黃萎病相關(guān)基因 GbEDS1 的克隆 與生物信息學(xué)分析 學(xué) 院： 農(nóng) 學(xué) 院 專業(yè)班級： 農(nóng)學(xué) 0902 班 學(xué) 號： 2020014010216 學(xué)生姓名： 劉 通 指導(dǎo)教師 姓名 ： 張 艷 指導(dǎo)教師 職稱 ： 講 師 二 O 一三 年 六 月 一 日 海島棉抗黃萎病相關(guān)基因 GbEDS1 的克隆 與生物信息學(xué)分析 農(nóng)學(xué)專業(yè) 劉通 摘要 ：本研究根據(jù)不同物種的 EDS1 核酸保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，利用 RTPCR 和RACE 技術(shù)從海島棉克隆抗黃萎病相關(guān)基因 EDS1 的 cDNA及開放閱讀框序列（ Open reading frame, ORF） 。 Verticillium wilt resisitance。 EDS1 誘導(dǎo)了 R 基因控制的抗性，即調(diào)節(jié)了活性氧的爆發(fā)及 HR 反應(yīng)的表達(dá)，并且通過在侵入位點積累水楊酸（ Salicylic Acid, SA）的方式增強(qiáng)了對病原菌的抵抗作用 [11, 12]。研究結(jié)果將為棉花抗黃萎病育種提供重要基因資源 ，為解析黃萎病抗性機(jī)制提供理論依據(jù)。待棉花幼苗子葉完全展開時，選取長勢一致的植株然后在無菌條件下將幼苗輕輕拔出 并浸泡在黃萎病菌孢子懸浮液中（孢子濃度為 15107cfu/mL） 30 秒 ， 并將處理后的幼苗重新移栽到 MS 培養(yǎng)基中生長 。 目的基因的 3′RACE、 5′RACE 擴(kuò)增 以反轉(zhuǎn)錄的 3′RACE或 5′RACE的 cDNA為模板，使用試劑盒中的通用引物 UPM和基因特異引物 GSP 進(jìn)行擴(kuò)增。 圖 3 5′ RACE和 3′ RACE反應(yīng)的 PCR擴(kuò)增 Fig. 3 PCR product amplified from 5′ RACE and 3′ RACE. M1, M2:DL2020 Marker。 圖 7 GbEDS1基因的亞細(xì)胞定位預(yù)測 Fig. 7 Prediction of Protein Localization Sites GbEDS1 的蛋白質(zhì)模體分析 利用 的 在線分析，分析該蛋白質(zhì)序列功能位點發(fā)現(xiàn)GbEDS1 蛋白含有 LIPASE_SER 同源區(qū)（圖 8）。今后的工作應(yīng)集中在通過構(gòu)建融合表達(dá)載體 和植物表達(dá)載體，進(jìn)行植物的遺傳轉(zhuǎn)化，看該基因的定位情況及相關(guān)功能，進(jìn)一步在更深層次上揭示該基因和棉花抗黃萎病的關(guān)系。 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)， GbEDS1 蛋白含有LIPASE_SER 同源區(qū)，序列內(nèi)部具有脂肪酶 絲氨酸活性位點、酪氨酸激酶磷酸化位點 N糖基化位點、蛋白激酶 C 磷酸化位點、 N 端肉豆蔻?；稽c、酪蛋白激酶 II 磷酸化位點和依賴 cAMP 和 cGMP 的蛋白激酶磷酸化位點，這些活性位點均是有效的活性位點，可能在激發(fā)子的識別過程中起重要作用。 圖 5 GbEDS1信號肽分析 Fig. 5 Analysis on the signal peptide of GbEDS1 protein GbEDS1 的跨膜結(jié)構(gòu)域的分析 使用專業(yè)網(wǎng)站 TMHMM（ 跨膜域預(yù)測（圖 6），結(jié)果分析：該基因的氨基酸序列存在明顯的跨膜螺旋，且從 140個氨基酸開始位于胞外，推測該蛋白屬于跨膜蛋白。 圖 2 GbEDS1基因 cDNA種子序列 PCR產(chǎn)物 PCR product of seed sequence of GbEDS1 cDNA M:DL2020 Marker。 使用 TaKaRa 公司的 PrimerScriptTM 反轉(zhuǎn)錄酶 試劑盒說明書所述反轉(zhuǎn)錄 RNA，獲得第一鏈 cDNA。選擇均勻飽滿無病蟲害的脫絨后的種子，用 %的HgCl2浸泡 8min，再用無菌水洗滌 46 次。 Gayoso, 2020）。隨著植物抗病機(jī)理研究的不斷深入和基因工程手段的運(yùn)用，通過向棉花中定向?qū)胪庠纯共』蛞蕴岣呙藁▽S萎病的抗性，創(chuàng)造新的抗病種質(zhì)已經(jīng)成為防治黃萎病的有效途徑 [3, 4]。 克隆 。 答辯報告 10 能簡明扼要、重點突出地闡述論文或設(shè)計的主要內(nèi)容，有新見解，結(jié)論明確；時間掌握恰當(dāng)。該生在做畢業(yè)論文的研究過程中基本掌握了本學(xué)科領(lǐng)域的基礎(chǔ)理論和專業(yè)知識。 指導(dǎo)教師意見： 論文選題針對性強(qiáng)，試驗材料有代表性，試驗方案可行，預(yù)期結(jié)果明確，同意開題。 (2) GbEDS1 基因的蛋白分析。目前 ， 植物抗病基因工程中常用的基因主要包括以下幾類 [1]：編碼引起植物廣譜抗性蛋白的基因 ， 編碼具有抑菌或抗菌活性蛋白的基因 ， 與植物結(jié)構(gòu)相關(guān)的防御基因 ， 病原菌致病因子的解毒或中和基因 ， 參與植保素代謝的基因，總之，表達(dá)這些基因的植物對真菌的抗性大都得到了不同程度的提高，其中，許多基因協(xié)同表達(dá)一般比單基因轉(zhuǎn)化效果明顯。 PGIP基因編碼的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白可以與真菌內(nèi)源多聚半乳糖醛酸酶非抑制性結(jié)合，降低了該酶的活性，抑制真菌的作用，同時還誘導(dǎo)寡聚糖的合成，進(jìn)一步誘導(dǎo)棉花的防御反應(yīng)。 Gayoso, 2020）。隨著植物抗病機(jī)理研究的不斷深入和基因工程手段的運(yùn)用，通過向棉花中定向?qū)胪庠纯共』蛞蕴岣呙藁▽S萎病的抗性，創(chuàng)造新的抗病種質(zhì)已經(jīng)成為防治黃萎病的有效途徑 [3, 4]。 按照開題報告的要求按期完成畢業(yè)論文各項工作的實施。 對該基因 進(jìn)行生物信息學(xué)分析預(yù)測其功能并為其功能的研究奠定理論依據(jù)。近年來， 植物發(fā)育生物學(xué)研究取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，許多重要的發(fā)育機(jī)制在分子水平上得以闡明，這就為利用遺傳工程的方法改造植物生長發(fā)育過程奠定了基礎(chǔ)。 可行性分析： 研究條件 課題組已有利 用 電子克隆方法、 RTPCR 和 RACE 技術(shù) ，從棉花中克隆出抗黃萎病相關(guān)基因的先例，并對基因進(jìn)行了表達(dá)特異性分析、原核表達(dá)分析。 ： 提取棉花總 RNA，獲得質(zhì)量較高的 RNA，進(jìn)行 cDNA 的片段合成 。 請按相關(guān)要求完成畢業(yè)論文任務(wù)。研究報道進(jìn)一步證實 EDS1 基因是植物抗病反應(yīng)中的一個重要信號元件。 參考文獻(xiàn) [1] Kumria R, Sunnichan V G, Das D K, et al. High frequency somatic embryo production and maturation into normal plants in cotton (Gossypium hirsutum) through metabolic stress[J]. Plant Cell Rep, 2020, 21: 635639. [2] 周兆華 , 張?zhí)煺?, 潘家駒 , 等 . 大 麗輪枝菌在棉花品種上的致病力分化研究 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2020, 33 (2): 5157． [3] 簡桂良 , 盧美光 . 棉花抗黃萎病品種選育方法探討 [J]. 植物病理學(xué)報 , 2020, 34(4): 356360. [4] 潘家駒 , 張?zhí)煺?. 黃萎病抗性遺傳研究 [J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 , 1994, 17(3): 818. [5] Falk A, Feys B J, Frost L N, Jones J D G, Daniels M J, and Parker J E. EDS1, an essential ponent of R genemediated disease resistance in Arabidopsis has homology to eukaryotic lipases [J]. Proc Natl Acad Sci USA 96, 1999, 32923297. [6] Jirage D, Tootle T L, Reuber T L, Frost L N, Feys B J, Parker J E, Ausubel F M, and Glazebrook J.