【正文】 ② 抑制細胞從植塊向外遷移 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 （ 1）表玻璃器官培養(yǎng)法 ? 1929年，費爾（ Fell）和魯濱遜 （ Robinson）建立 （ 2）瓊脂凝膠培養(yǎng)法 ?沃爾夫（ Wolff）和施奈德（ Schneider） （ 3）懸浮培養(yǎng)法 （ 4）直接漂浮培養(yǎng)法 ? 1948年，梅達沃（ Medawar）設計 （ 5）擦鏡紙培養(yǎng)法 （ 6）金屬格柵器官培養(yǎng)法 1954年，特羅爾（ Trowell）創(chuàng)立。 （ 4）目前對細胞代謝和生長動力學的研究比較欠缺。 ? （ 2）骨骼肌的培養(yǎng) 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng) ? 神經(jīng)組織包括：神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞 ? 1907年，哈里森首創(chuàng)培養(yǎng)方法。表皮細胞對角蛋白特異性單克隆抗體反應陽性，間充質(zhì)細胞對波型絲特異性單克隆抗體反應陽性。迄今為止，全球范圍內(nèi)建立的細胞系目前已經(jīng)超過三位數(shù)。親緣關(guān)系近的靈長類細胞系之間和人癌細胞系之間的比較可用 Giemsa顯帶分析。加標記有熒光染料（ FITC）的山羊抗兔免疫球蛋白抗體。 1 、細胞克隆形成率實驗 克隆形成試驗是測定單個細胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是單個細胞在體外增殖 6代以上，其后代所組成的細胞群體形成肉眼可見的克隆。 ? 分裂指數(shù)指細胞群體中分裂細胞所占的百分比，它是測定細胞周期的一個重要指標，也是不同實驗研究選擇細胞的重要依據(jù)。 ? 操作步驟 （ 1）單細胞懸液接種于 96孔培養(yǎng)板； 103104細胞 /孔，每孔培養(yǎng)基總量 200微升（ 96孔培養(yǎng)板每孔容積 370微升）， 37℃ 、 5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗目的決定培養(yǎng)時間） （ 2）加入 2毫克／毫升的 MTT液（ 50微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng) 3小時。 ? 根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果按每個小方瓶 5 104／ mL作傳代培養(yǎng)接種細胞，共接種 21瓶細胞。 污染的預防 ? 培養(yǎng)前 培養(yǎng)操作時 其他注意事項 必要的細胞備份 對新引進或構(gòu)建的細胞株應加強觀察，并做必要的支原體和病毒的檢查。 ? 鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)，其中央有電子密度大的密度顆粒群或絲狀的中心束。 防止，酒精棉球擦洗清除瓶口污染，必要時加入抗真菌劑。更換營養(yǎng)液時間，可依營養(yǎng)物的消耗而定，細胞生長旺盛時２－３天換一次，生長緩慢時，３－４天亦可。 細胞生長情況 ? 很多情況下，開始從組織最先“長”出的為游走細胞，它們單獨活動，形態(tài)不規(guī)則，用縮時逐格顯微電泳法可揭示出它們極活躍的變形、游走和吞噬活動。細胞容易發(fā)生變異，且對 設備等要求高。 ? 可以模擬細胞體內(nèi)三維狀態(tài)。 ?多孔載體培養(yǎng) 優(yōu)點：易固定化、比表面大、細胞在載體內(nèi)生長，免受機械損傷；可以提高通氣量，強化傳質(zhì)。 培養(yǎng)板培養(yǎng)法 ? 培養(yǎng)板培養(yǎng)法又稱微量培養(yǎng)法。 灌注小室培養(yǎng)法 ? 在蓋玻片懸滴法基礎(chǔ)上發(fā)展而來，可用于連續(xù)觀察細胞動態(tài)變化，研究各種因素影響作用及活細胞反應。 二、動物細胞培養(yǎng)的基本方法 ? 懸滴培養(yǎng)法 ? 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 ? 灌注小室培養(yǎng)法 ? 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法 ? 培養(yǎng)板培養(yǎng)法 ? 克隆培養(yǎng)法 懸滴培養(yǎng)法 ? 懸滴培養(yǎng)法：又稱植塊懸滴培養(yǎng)法， 1907年，哈里森首創(chuàng)。 (2)程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機以 1～ 3℃ /分鐘之速度由室溫降至 (80℃ 以下 )120℃ ，再放在液氮長期儲存。 ? 復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。過早產(chǎn)量不足，過晚細胞狀態(tài)不佳。 ? 特點細胞雖已停止生長，但仍存在代謝活動并可繼續(xù)存活一定的時間。持續(xù) 3~5天。 熒光原位雜交顯示端粒 結(jié)果：細胞群體中具有迅速增殖能力的細胞將漸占優(yōu)勢而非增殖的或增殖緩慢的細胞將被減弱。 ? 有限細胞系和永久細胞系 ? 動物細胞離體培養(yǎng)起始物，我們稱之為原代培養(yǎng)（ primary culture）。上述這種生長特性即為密度依賴性調(diào)節(jié)（或密度抑制）。 ? 貼附底物：其他細胞、膠原、玻璃或塑料等。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。主要是：單核巨噬細胞系統(tǒng)的細胞，淋巴細胞，腫瘤細胞。取自不同組織的上皮細胞，其生化特征及其原來的形態(tài)要有差異，而來自不同組織的形態(tài)相似的成纖維細胞，其發(fā)展的方向可能并不相同 。 （ 2） 上皮型細胞 ? 此類型細胞在培養(yǎng)器皿支持物上生長具有扁平狀，不規(guī)則。 （一）培養(yǎng)細胞的生長方式及類型 （二） 培養(yǎng)細胞的生長特點 （三） 培養(yǎng)細胞的生長與增殖過程 五、 動物細胞的體外培養(yǎng)生物學特性 貼壁依賴型細胞 非貼壁依賴型 成纖維細胞 上皮型細胞 游走型細胞 多形型細胞 （一）培養(yǎng)細胞的生長方式及類型 于懸浮狀態(tài)下即可生長 貼附于支持物表面才能生長的細胞 貼壁依賴型細胞 ? 含義：一是細胞之間相互接觸，二是細胞與細胞外基質(zhì)結(jié)合。人體細胞培養(yǎng)的標準溫度為 ℃ 177。 ? 1948年， Sanford創(chuàng)立了單層細胞培養(yǎng)法，建立了各種細胞系。他被公認為動物組織培養(yǎng)的開山鼻祖。 ? 更易受微生物污染 （包括細菌、真菌、病毒、支原體）， 需要 防治污染問題 。 ? 是動物細胞工程的基礎(chǔ)。 無限細胞系 (finited cell line)： 能夠連續(xù)培養(yǎng)的細胞株，也稱無限系。 平滑肌細胞 神經(jīng)元細胞 血紅細胞 形態(tài)上表現(xiàn)為多種多樣，如圓形、橢圓形、正方形、柱形、扁平形、梭形、星形和多邊形等． 三、動物細胞培養(yǎng)的發(fā)展歷史 ? 1885年， Wilhelm Roux （勞斯，德國）最先嘗試離體培養(yǎng)雞胚神經(jīng)存活了一段時間。 ? 1925年， Maximow采用雙蓋片法。 ?1962年，岡田善雄又發(fā)現(xiàn)了已滅活的仙臺病毒可以誘發(fā)體內(nèi)艾氏腹水瘤細胞和非惡性細胞融合。 無菌 ?培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細胞生存的首要條件。 人的成纖維細胞 小鼠的成纖維細胞 人骨髓間充質(zhì)細胞（ MSC） 大鼠血管平滑肌細胞 成纖維細胞型 ?成纖維型細胞 在培養(yǎng)中的細胞凡形態(tài)與成纖維細胞類似時，皆可稱之為成纖維細胞。 ? Hela細胞呈現(xiàn)為典型的上皮細胞型 。在一定的條件下，由于細胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細胞形態(tài)。如神經(jīng)組織細胞如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等。 ?影響細胞形態(tài)學特征的因素 血清成分、培養(yǎng)基成分、添加成分、培養(yǎng)基的酸堿度、氣相環(huán)境、溫度等。 ? 一般的正常細胞并不互相重疊于其上面而生長；但是，轉(zhuǎn)化細胞或癌瘤細胞則接觸抑制下降，他們互相之間可在上面或下面經(jīng)過而重疊生長。 (2)傳代期 ? 當細胞持續(xù)生長增殖一段時間，達到一定的細胞密度后，就應當將細胞分離成兩部分（或更多）至新的培養(yǎng)器皿中，并補充更新培養(yǎng)液，此即為傳代。 ? 大多數(shù)細胞系在有限的代數(shù)內(nèi)以不變的形式增殖，當超過有限世代后 ，它們可能有兩種情況，一是衰老死亡，二是發(fā)育成永久細胞系或稱連續(xù)細胞系。 細胞”一代”：僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一 段時間。細胞不再繁殖而進入平臺期。 ? 一般而言幼體組織比老齡組織，分化低的比分化高，腫瘤組織比正常組織易于培養(yǎng)。 凍存和復蘇的原則：慢凍快融 ? 當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。 細胞凍存方法 1預先配制凍存液： 含 20%血清培養(yǎng)基 9份 DMSO 1份 2 取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液 , 用吸管吹打制成細胞懸液（ 1 106 ～ 5 106細胞 /ml) 3 分裝：每瓶 1ml，密封后標記冷凍細胞名 稱和冷凍日期。 （ 2） 5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的 10倍以上 。 ? 特點：是培養(yǎng)中組織塊或細胞交替地與培養(yǎng)液和空氣直接接觸。采用的材料對細胞無毒，透明。 ? 原理：其原理是將對細胞無害的顆粒 微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。 ? 制備中應注意： ? 溫和、快速、不損傷細胞，盡量在液體和生理條件下操作； ? 所用試劑和膜材料對細胞無毒害； ? 膜的孔徑可控制，必須使營養(yǎng)物和代謝物自由通過； ? 膜應有足夠機械強度抵抗培養(yǎng)中攪拌。而且收液率低 . 優(yōu)點：生產(chǎn)效率高，可反復長期培養(yǎng)，反復收獲產(chǎn)品。只有狀態(tài)良好的細胞才宜利用進行實驗。用一般溫箱培養(yǎng)時，隨細胞生長時間的延長， CO2積累增多，在超越緩沖范圍后，營養(yǎng)液酸化變黃，如不及時調(diào)節(jié) PH，對細胞會發(fā)生不利影響，嚴重時細胞脫落死亡。 防止，通常在嚴格的實驗操作之外，培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素能夠有效的防止細菌污染。染色后用蒸餾水洗 12min，向細胞面滴加 酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。 4）病毒的污染及檢測 ? 濾器對病毒沒有任何阻擋作用，通常不容易被污染，因為病毒不能在細胞外復制，而且它們通常具有宿主細胞的感染限制。 ? 鏡下觀察計數(shù)： 計算計數(shù)板四角大格內(nèi)的細胞數(shù)，壓線者只計算 左側(cè)和上方的 ,右側(cè)和下方的不計算在內(nèi)。 2）、 四唑鹽（ MTT）比色法 ? 四唑鹽 （ MTT） 商品名為噻唑藍 ， ? 四 唑 鹽比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四 唑 鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物（ formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。 ? 用于測細胞增殖、細胞存活和細胞毒性。 3） 計算 : 分裂指數(shù) =分裂細胞數(shù) /總細胞數(shù) 100% 細胞周期 （ 1）放射性核素標記自顯影 用 3H標記脫氧胸腺嘧啶核苷 處理 30min后，每間隔 30min取材，直到 48h為止，觀察和計算細胞分裂相出現(xiàn)時間、高峰和消失分裂相數(shù)，繪圖分析。 ? 缺點：操作繁瑣 ? 優(yōu)點：精確、可靠 臺盼藍法 ? 活細胞不被染色 ， 死細胞染成藍色 ， 用活細胞占 ? 細胞中的百分比表示細胞活力 ? 臺盼藍排斥試驗： （ 1）臺盼藍濃度： 母液： 4%，用雙蒸水配制；工作液：%，用 PBS稀釋。根據(jù)同種異體同工酶的表型和正常人群體的表型頻率資料，可以估計出一特定細胞系遺傳特征出現(xiàn)的頻率。 ? 腫瘤細胞的體外培養(yǎng)與建系過程 ? 上皮細胞培養(yǎng) ? 表皮組織培養(yǎng) ? 肌肉組織培養(yǎng) ? 神經(jīng)元細胞培養(yǎng) 第四節(jié) 動物細胞體外培養(yǎng)舉例 腫瘤細胞的體外培養(yǎng)的歷史 ? 1906年， Beebe和 Ewing最早成功培養(yǎng)狗的淋巴肉瘤細胞； ? 1911年， Carrel最先在體外培養(yǎng)了纖維軟骨瘤及黑色素瘤細胞。