nf-kb的激活與檢測(cè)方法-免費(fèi)閱讀
【正文】 因此，對(duì)NFκB進(jìn)一步的研究，對(duì)其激活和抑制機(jī)理的了解，將有助于治療炎癥，癌癥等各種疾病。(4)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)報(bào)告基因：GFP在紫外光下發(fā)射熒光，其熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)，可以被多種方法檢測(cè)。第二抗體與辣根過氧化物酶共軛結(jié)合后提供了敏感的顯色反應(yīng)，這可以方便的用分光光度法定量測(cè)定。放射性EMSA 敏感性高，而且特異性強(qiáng)。4. 檢測(cè)方法．蛋白印跡(Western blot)可以從兩個(gè)方面應(yīng)用Western blot進(jìn)行檢測(cè)，一是NFκB的表達(dá)量，生理?xiàng)l件下NFκB存在一定量表達(dá)，疾病及各種外源刺激下NFκB表達(dá)量發(fā)生異常改變；二是可以檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中IκB的降解，細(xì)胞未受到任何刺激時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的NFκB處于未活化狀態(tài)，NFκB／IκB復(fù)合物以無活性方式將NFκB滯留于胞漿，當(dāng)細(xì)胞受到外界因素刺激時(shí)，NFκB與IκB分離，NFκB進(jìn)入細(xì)胞核，IκB則被降解。谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的毒性伴隨著NFκB 的誘導(dǎo)，NFκB的激活引起了細(xì)胞死亡。Wang等發(fā)現(xiàn)NFκB能夠通過激活bcl2家族中的A1／Bfl一1而抑制了由TNF—α引起的凋亡。因此B細(xì)胞中一定水平的NFκB對(duì)于保證細(xì)胞存活及增殖有重要的作用【13】。這些途徑包括酪氨酸磷酸化誘導(dǎo)的IκBs解離途徑途徑和蛋白激酶2誘導(dǎo)的IκBs的流動(dòng)加快的方式。2．NFκB的激活細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NFκBIκBs復(fù)合物(NFκBIκBα、NFκBIκBε)在胞漿與胞核之間穿梭，處于動(dòng)態(tài)平衡?！?】IκB激酶IKK是IκB離開NFκB并使之得以活化的必需前提，隨之降解抑制因子IκB。該類蛋白含有RHD，但缺乏轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，無獨(dú)立激活基因轉(zhuǎn)錄的功能。1986年，Sen 等【2】首次從鼠B淋巴細(xì)胞核提取物中，發(fā)現(xiàn)一種能與免疫球蛋白K輕鏈基因增強(qiáng)子KB序列(GGGACTTTCC)特異結(jié)合，調(diào)節(jié)其基因表達(dá)的核蛋白因子，稱之為NFκB。它們可以調(diào)節(jié)許多與免疫功能和炎癥有關(guān)的基因，在機(jī)體生理和病理?xiàng)l件下，發(fā)揮重要的功能。另一類為p65(RelA)，Rel（cRel),Rel B和果蠅的dorsal、Dif和Relish,它們沒有前體，除N端的RHD外，其C端有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，具有直接作用轉(zhuǎn)錄設(shè)備而激活基因轉(zhuǎn)錄的功能。IKK是由一個(gè)調(diào)節(jié)亞單位，IKKγ(也被稱為NEMO)和兩個(gè)催化亞單位IKKα，IKKβ組成。各種信號(hào)通過降解IκBs的方式來活化NFκB，活化的NFκB然后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合。釋放后的NFkB可以通過例如修飾自身的亞單位的方式來影響自身的轉(zhuǎn)錄激活效能。目前，NFκB主要通過以下三條途徑來抑制凋亡【14】。(3)NFκB通過誘導(dǎo)TRAF(TNF受體相關(guān)因子)和IAP(凋亡抑制蛋白)抑制凋亡【18】。實(shí)驗(yàn)顯示，辛德畢斯(Sindbis)病轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在細(xì)胞凋亡的起始階段甚至需要NFκB的參與【20】。Western blot可以反映NFκB蛋白表達(dá)量的變化情況，從而可作為研究其功能的一種手段。非放射性EMSA勿需經(jīng)過放射顯影，采用生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光原理進(jìn)行檢測(cè)，敏感度與放射性EMSA相近。此試劑盒是一個(gè)快速，使用方便且敏感特異的試驗(yàn)方法。該報(bào)告基因檢測(cè)不需要底物，GFP表達(dá)穩(wěn)定，加熱、變性劑、去垢劑及一般的蛋白酶均不能使它滅活【22】。參考文獻(xiàn)1．Baldw in ASJ．The NFkappa B and I kappa B proteins：new discoveries and insights．Annu Rev Immunol，1996，14：649．2 Sen R，Baltimore D．Inducibility of the immunoglobulin enhancerbinding protein NFκB by a posttranslational mechanism．Cell，1986，47：921283 Thanos D ,Maniatis T. NF kappa B : a lesson in family values. Cell ,1995 ,80 (4) :529～5324汪福州 景亮對(duì)核因子NFκB 在免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋
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